DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 3-4/2017 str. 11 <-- 11 --> PDF |
tla ravnomjerno je raspoređeno u plastične posude dimenzija 23,5 x 15 x 5 cm te potopljeno ultračistom vodom (0,055 μS/cm) volumena 500 ml, tako da je površina vode bila 1 do 2 cm iznad površine tla. Ovako pripremljeni uzorci ostavljali su se tri dana na sobnoj temperaturi (18-22 °C) u poklopljenim posudama (Vettraino i sur. 1999), nakon čega se na površinu vode postavljalo 3 do 5 razvijenih i svježe ubranih listova vrsta Rhododendron catawbiense Michx. i Prunus laurocerasus L. Listovi su prethodno oprani vodom iz slavine, uz lagano četkanje kako bi se uklonile veće nečistoće te zatim kratko isprani u sterilnoj vodi (sterilizacija u autoklavu na 121 °C, 20 min) i ostavljeni da se u potpunosti osuše unutar laminarnog kabineta za rad u atmosferi čistog zraka. Posude s postavljenim listovima su se lagano zaklopljene ostavljale na sobnoj temperaturi i prirodnom režimu svjetlosti 2 do 8 dana, odnosno do pojave prvih simptoma infekcije gljivama sličnih organizama na lišću (kloroza i nekroza). Izolacija gljivama sličnih organizama iz simptomatičnih listova – Isolation of fungal-like organisms from symptomatic leaves Za izolacije gljivama sličnih organizama iz simptomatičnih listova pripremljene su hranjive podloge 10 % CJA (Carrot Juice Agar, sok mrkve iz biološkog uzgoja, dmBIO Karottensaft) te 10 % VJA (Vegetable Juice Agar, povrtni sok iz biološkog uzgoja, Biotta Breuss). Za pripremu 1 litre navedenih podloga je u 100 ml soka dodan 1 g kalcijevog karbonata (CaCO3) uz stalno miješanje na 150 °C u trajanju od 20 minuta, te zatim 900 ml destilirane vode i 15 g agar-agara, uz stalno miješanje na 250 °C u trajanju od približno 30 minuta (Jeffers 2007). Prije izlijevanja u sterilne Petrijeve zdjelice, hranjive su podloge sterilizirane u autoklavu 20 minuta na 121 °C, te je u njih dodana vodena otopina antibiotika (1 % streptomicin sulfat, 20 ml/l) nakon što su ohlađene na približno 55 °C. Za rast čistih kultura su se koristile hranjive podloge PDA (Potato Dextrose Agar, Difco) i MEA (Malt Extract Agar, Difco) pripremljene prema uputama proizvođača. Listovi s vidljivim simptomima infekcije oprani su vodom iz slavine, zatim površinski sterilizirani uranjanjem u 0,04 % otopinu NaOCl u trajanju dvije minute, te tri puta isprani u sterilnoj vodi, nakon čega su ostavljeni da se u potpunosti osuše unutar laminarnog kabineta za rad u atmosferi čistog zraka (Themann i Werres 1999). Komadići listova veličine približno 3 x 3 mm uzimani su s ruba klorotičnog i/ili nekrotičnog tkiva te uronjeni u hranjive podloge, tako da su čitavom površinom bili u dodiru s antibiotikom, čime se nastojao spriječiti razvoj bakterija. Ovako pripremljene Petrijeve zdjelice inkubirane su u tami na 21 °C. Rast micelija praćen je svakodnevno tri tjedna uz redovito presađivanje, kako bi se dobile čiste kulture. Indukcija sporangija – Induction of sporangia Mikroskopskim pregledom dobivenih čistih kultura micelija utvrdilo se kako ne postoje morfološke značajke koje bi pomogle u identifikaciji, stoga je inducirana tvorba sporangija korištenjem tri različite nesterilne otopine tla. Kockice hranjivih podloga zajedno s pripadajućim micelijem površine približno 0,5 cm2 izrezane su s ruba kultura starih 4 do 7 dana te u sterilnim Petrijevim zdjelicama promjera 9 cm |