DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu



ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 52     <-- 52 -->        PDF

23°C u prirodnim uvjetima izmjene dana i noći, kako bi se razvio micelij gljive. Dobivena kultura gljive morfološki je analizirana i uzeti su uzorci micelija sa PDA podloge za molekularnu detekciju.
Molekularna detekcija – Molecular detection
DNA izolacija – DNA isolation
DNA je izolirana iz 0,1 g piljevine zaraženog drveta prema protokolu kompleta QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Germany) te iz micelija sastruganim s površine agara CTAB metodom (Doyle JJ i Doyle JL 1987) koristeći 2 % cetil trimetil ammonium bromid (CTAB) pufer uz dodatak 1 % (wt/vol) polivinilpirolidina (PVPP). DNA je resuspendirana u 50 µl ultračiste vode. Kvaliteta i kvantiteta DNA je provjerena elektroforezom u 1x TBE puferu, pH 8,0 na 0,8 % agaroznom gelu obojanom s bojom GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Rockland, Inc. Rockland, USA). Kao DNA marker korišten je Lambda DNA/Hind III Fragment (Invitrogen, Germany).
PCR umnažanje i sekvenciranje – PCR amplification and sequencing
PCR reakcija umnažanja DNA ITS početnicama je sadržavala 1x PCR pufer, 0,8 µg/µl BSA (Bovine Serum Albumin, Amersham Pharmacia Biotech, USA), 0,5 µM ITS 3 i ITS 4 (White et al. 1990), 1 u TaKaRa Taq Hot Start (Takara, Japan) i 0,5 µl izolirane DNA u razrjeđenju 1:100. Parametri amplifikacijskog ciklusa su bili sljedeći: početna denaturacija 5 min, 94 °C i 30 ciklusa: 1 min 95 °C, 1 s 56 °C i 1 min 72 °C te završni ciklus od 10 min, 72 °C. PCR reakcija umnažanja DNA dijagnostičkim početnicama je sadržavala 1x PCR pufer, 0,8 µg/µl BSA 0,5 uM početnica EpF i EpR (Piškur et al. 2007), 1 u TaKaRa Taq Hot Start (Takara, Japan) i 0,5 µl izolirane DNA u razrjeđenju 1:100. Parametri amplifikacijskog ciklusa su bili sljedeći: početna denaturacija 85 s, 94 °C i 35 ciklusa: 35 s, 95 °C; 55 s 60 °C i 1 min 72 °C te završni ciklus od 10 min, 72 °C. Sve PCR reakcije provedene su s negativnom kontrolom koja je sadržavala ultračistu vodu umjesto DNA. Umnažanje DNA fragmenata provedeno je u ukupnom volumenu od 10 µl u uređaju PTC-100 (MJ Research, USA). PCR produkti provjereni su elektroforezom na 1,8 % agaroznom gelu obojanom GelStar Nucleic Acid Gel Stain, (Lonza Rockland, Inc. Rockland, USA) u 1x TBE pufer pH 8,0 i DNA markerom Tracklt 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, Germany) i UV svijetlom. Umnožena DNA je pročišćena iz agaroznog gela korištenjem kompleta PureLink Quick gel Extraction kit (Invitrogen, Germany). Automatsko sekvencioniranje je izvedeno pomoću kompleta BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) na instrumentu 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Analiza sekvenci provedena je usporedbom sekvenci DNA prisutnih u GenBank (NCBI, Bethesda, MD, USA) koristeći program BLAST (Basic Local Aligment Search Tool).