DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu




ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 49     <-- 49 -->        PDF

Eutypella parasitica R.W. Davidson & R.C. Lorenz SEDAM GODINA NAKON PRVOG NALAZA U HRVATSKOJ
Eutypella parasitica R.W. Davidson & R.C. Lorenz SEVEN YEARS AFTER THE FIRST FINDINGS IN CROATIA
Sanja Novak Agbaba, Nevenka Ćelepirović, Monika Karija Vlahović, Boris Lović
Sažetak
Gljiva Eutypella parasitica uzročnik je bolesti raka kore javora. Ta bolest umanjuje ekonomsku i estetsku vrijednost javora. Na zaraženim dijelovima stabala dolazi do truljenja drva, što oslabljuje statiku stabla i predstavlja opasnost od loma.
U Europi je bolest raka kore javora prvi puta registrirana u Sloveniji 2005. godine. Od 2005. do 2008. godine bila je na EPPO Alert listi zbog opasnosti od širenja zaraze.
U Hrvatskoj je bolest rak kore javora registrirana prvi puta 2007. godine na A. campestre u blizini granice sa Slovenijom. Od 2011. godine u Hrvatskoj se provodi program Poseban nadzor gljive E. parasitica.
Cilj ovoga rada je utvrditi stanje zaraze rakom kore javora sedam godina nakon prvog nalaza, rasprostranjenost bolesti i intenzitet zaraze u Hrvatskoj. Drugi cilj je potvrditi vrstu gljive fitopatološkom i molekularnom analizom te pohraniti njihove DNA sekvence ITS2 regije u GenBank (NCBI).
U razdoblju od 2011. do 2014. godine pregledane su šumske sastojine u kojima su zastupljena stabla javora na području 8 županija i 17 lokaliteta. Od ukupno pregledanih 2209 stabala, svega 2 stabla (A. pseudoplatanus i A. campestre) u blizini mjesta Hum na Sutli uz slovensku granicu bila su zaražena rakom kore, što iznosi 0,09 % zaraženih stabala. Zaraza rakom kore javora je vrlo malog intenziteta i bolest se nije proširila na druge lokalitete. Na uzorcima rakastih tvorevina laboratorijskim analizama, fitopatološkom analizom i DNA analizom dijagnostičkim početnicama, potvrđena je prisutnost gljive E. parasitica. Fragmneti DNA su sekvencirani te je napravljena usporedba u genskoj bazi podataka (GenBank, NCBI) gdje je potvrđeno da se radi o 100 % istovjetnosti s E. parasitica. ITS2 regija gljive E. parasitica utvrđena na gorskom javoru i na klenu, sekvencirana je i pohranjena u gensku banku (GenBank, NCBI) pod pristupnim brojevima KP868619 i KP868620.
E. parasitica je prvi puta utvrđena u Hrvatskoj na klenu (A. campestre) 2007. Godine 2013. prvi puta je utvrđena u Hrvatskoj na gorskom javoru (A. pseudoplatanus), a 2014. godine potvrđena je na klenu (A. campestre). Vrsta gljive E. parasitica potvrđena je fitopatološkom i molekularnom DNA detekcijom. Zaraza rakom kore javora nije se proširila zadnjih sedam godina u Hrvatskoj.
KLJUČNE RIJEČI: Eutypella parasitica, rak kore javora, Acer pseudoplatanus, Acer campestre, molekularna dijagnostika, ITS2 regije

ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 50     <-- 50 -->        PDF

UVOD
Introduction
Gljiva Eutypella parasitica R.W. Davidson & R.C. Lorenz uzročnik je bolesti rak kore javora. Rak kore javora porijeklom je iz Sjeverne Amerike, gdje dolazi na različitim vrstama javora Acer saccharum, A. rubrum, A. saccharum subsp. nigrum, A. pensilvanicum, A. negundo, A. platanoides, A. pseudoplatanus, (European Plant Protection Organisation, EPPO 2006). U Europi je bolest rak kore javora prvi puta registrirana u Sloveniji 2005. godine na području Ljubljane (Jurc et al. 2006). Do kraja siječnja 2006. intenzivnim pregledom detektirano je 76 zaraženih javora (A. pseudoplatanus, A. platanoides, A. campestre), provedene su mjere eradikacije i sva zaražena stabla su oborena i spaljena (EPPO Reporting service 2006/143). U Austriji je registrirana u prosincu 2006. godine na rubu šume na području Lilienfeld (Cech 2007) na gorskom javoru A. pseudoplatanus. Rizik širenja bolesti raka kore prema Ogris et al. (2006.) u Europi je znatan na području prirodnog rasprostranjena javora. Najugroženija su područja Balkana, Apenina, Francuske, Centralne i Istočne Europe i Kavkaza. Hrvatska spada u područje visokog rizika širenja bolesti rak kore javora. E. parasitica stavljena je 2005. godine na EPPO Alert listu po preporuci NPPO (National Plant Protection Organisation) Slovenija. Godine 2008. skinuta je s EPPO Alert liste (EPPO RS 2008/028) iz razloga što se bolest sporo širi, a širenje bolesti ne može se zaustaviti. Iskorjenjivanje nije moguće, a štete su male. U većini slučajeva postotak zaraze javora rakom u šumi i urbanim sredinama iznosi 2 – 10 % (Moorman 2012).
U Hrvatskoj je bolest rak kore javora prvi puta utvrđena 2007. godine u blizini granice sa Slovenijom u mjestu Prišlin (Ogris et al. 2008) na 13 stabala klena (A. campestre). Prilikom tog prvog nalaza zaraze gljivom E. parasitica u Hrvatskoj gljiva je detektirana PCR metodom dijagnostičkim početnicama (Ogris et al. 2008).
U Hrvatskoj se od 2011. godine provodi program Poseban nadzor gljive E. parasitica. Program nadzora provodi šumarska inspekcija i Hrvatski šumarski institut koji financira Ministarstvo poljoprivrede (Liović 2012). Cilj nadzora je utvrditi status gljive u Hrvatskoj, pratiti pojavu i širenje bolesti te poduzeti odgovarajuće mjere zaštite kako bi se bolest iskorijenila.
E. parasitica prema znanstvenoj klasifikaciji pripada odjelu Ascomycota, razredu Sordariomycetes, redu Xylariales, porodici Diatrypaceae, rodu Eutypella (www.indexfungorum.org/Names).
Gljiva E. parasitica, uzročnik raka kore javora stvara veliki kalus oko središta rakaste tvorevine koji podsjeća na kobrinu glavu (Hudler 1984). Tipični rak ima ravan ili utonulo središte s mrtvom korom okružen debelim kalusom (EPPO RS 2008/028). Na površini kore nalaze se crna reproduktivna tijela gljive, a kad se odstrani kora s rubova raka može se vidjeti tkivo gljive (Hudler 1984). Micelij je lepezastog oblika, bijele do krem boje (Ogris et al. 2008). Rak je mjesto truleži drva, a bolesno stablo se često prelomi pod djelovanjem jakog vjetra (Hudler 1984). Plodna tijela gljive, strome s peritecijima, formiraju se u središnjem dijelu rakaste tvorevine 5 – 8 godina nakon infekcije (Cech 2007). U vrijeme vegetacije oko središta raka raste kalus 1,5 do 2,0 cm godišnje, a u vrijeme mirovanja vegetacije gljiva E. parasitica razara tkivo drva (Koetter i Grabowski 2015). Periteciji otpuštaju askospore jedino kada se natope vodom za kišnog vremena (Landache 1971). Askospore se šire vjetrom i kišom maksimalno do udaljenosti 25 m i visine 4 m (Johnson i Kuntz 1979). Gljiva E. parasitica proizvodi i konidije, ali one ne kliju i ne predstavljaju izvor infekcije (Glawe 1983 u Cech 2007, Moorman 2012).
Bolest rak kore umanjuje estetsku i ekonomsku vrijednost javora. Zaražena stabla su osjetljiva i često ih dodatno naseljuju gljive truležnice koje oslabljuju statiku stabla, što predstavlja opasnost od lomova (EPPO RS 2008/028).
Identifikacija E. parasitica provodi se klasičnom fitopatološkom metodom zapažanja vidljivih simptoma i analizom morfoloških karakteristika gljive na drvetu i u kulturi na hranjivoj podlozi.
Brza metoda detekcije uključuje analizu DNA primjenom dijagnostičkih početnica PCR metodom (Polimeraze Chain Reaction – Lančana reakcija polimeraze). Piškur et al. (2007) su napravili dijagnostičke početnice za gljivu E. parasitica, pretraživajući unutrašnje transkribirano područje (Internal Trancibed Spacer region, ITS) ribosomske DNA uzoraka E. parasitica nađenih na različitim lokacijama i domaćinima u Sloveniji i usporedbom njihovih sekvenci s Eutypella spp. pohranjenim u GenBank (NCBL, National Center for Biotechnology Information).
Cilj ovoga rada je utvrditi stanje zaraze rakom kore javora sedam godina nakon prvog nalaza, rasprostranjenosti bolesti i intenzitet zaraze u Hrvatskoj. Drugi cilj je potvrditi vrstu gljive fitopatloškom analizom i DNA analizom dijagnostičkim početnicama te pohraniti njihove DNA sekvvence ITS2 regije u GenBank (NCBI).
MATERIJALI I METODE
Materials and methods
Područje rada – Research area
Programom posebnog nadzora E. parasitica u razdoblju od 2011. do 2014. godine pregledane su šumske sastojine (Slika 1.) u kojima su zastupljena stabla javora na području graničnih županija sa Republikom Slovenijom te nekoliko županija u unutrašnjosti Hrvatske. Pregledi su obavljeni na području 8 županija i 17 lokaliteta (Tablica 1.).

ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 51     <-- 51 -->        PDF

Terenski rad – Field work
U šumskim sastojinama obavljeni su vizualni pregledi stabala javora Acer spp. u potrazi za simptomima raka kore. Stabla na kojima su uočeni simptomi zaraze su oborena i uzeti su uzorci dijelova debla s rakastom tvorevinom za laboratorijsku fitopatološku i molekularnu analizu. Zabilježene su koordinate stabala sa simptomima zaraze. Izmjeren je prsni promjer stabala, određena je njihova starost, izmjerena je visina na kojoj se rakasta tvorevina nalazi. Izmjerena je širina i visina rakaste tvorevine na stablu.
Laboratorijski rad – Laboratory work
Fitopatološka analiza i detekcija – Phytopathological analysis and detection
Uzorci dijelova debla, trupčići s rakastom tvorevinom okularno su pregledani. Analizirani su simptomi raka, pregledna je kora na prisutnost plodnih tijela, odstranjen je dio kore u potrazi za micelijem gljive. Uzorci kore zajedno s plodnim tijelima gljive su mikroskopski analizirani. Izmjerena je dimenzija askospora i određene su veličine: minimum, maksimum i srednja vrijednost. Korištena je zoom stereo lupa Olympus SZX7 i svjetlosni mikroskop Olympus BX53.
Trupčić sa simptomima zaraze gljivom prerezan je okomitim rezom na kojemu je bio vidljiv prijelaz zaraženog u zdravo drvo. Trupčić je držan u radnom zatvorenom predprostoru laboratorija u promjenjivim klimatskim uvjetima ovisnim o vanjskim vremenskim uvjetima. Prosječna temperatura kretala se oko 15 °C, a vlažnost zraka oko 85 %.
Komadići drva s trupčića na prijelazu nekrotiziranog u zdravo tkivo veličine 5x5mm su izrezani sterilnim skalpelom i inokulirani na hranjivu podlogu PDA (Potato dextrosa agar) u petrijeve zdjelice i ostavljeni na sobnoj temperaturi

ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 52     <-- 52 -->        PDF

23°C u prirodnim uvjetima izmjene dana i noći, kako bi se razvio micelij gljive. Dobivena kultura gljive morfološki je analizirana i uzeti su uzorci micelija sa PDA podloge za molekularnu detekciju.
Molekularna detekcija – Molecular detection
DNA izolacija – DNA isolation
DNA je izolirana iz 0,1 g piljevine zaraženog drveta prema protokolu kompleta QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Germany) te iz micelija sastruganim s površine agara CTAB metodom (Doyle JJ i Doyle JL 1987) koristeći 2 % cetil trimetil ammonium bromid (CTAB) pufer uz dodatak 1 % (wt/vol) polivinilpirolidina (PVPP). DNA je resuspendirana u 50 µl ultračiste vode. Kvaliteta i kvantiteta DNA je provjerena elektroforezom u 1x TBE puferu, pH 8,0 na 0,8 % agaroznom gelu obojanom s bojom GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Rockland, Inc. Rockland, USA). Kao DNA marker korišten je Lambda DNA/Hind III Fragment (Invitrogen, Germany).
PCR umnažanje i sekvenciranje – PCR amplification and sequencing
PCR reakcija umnažanja DNA ITS početnicama je sadržavala 1x PCR pufer, 0,8 µg/µl BSA (Bovine Serum Albumin, Amersham Pharmacia Biotech, USA), 0,5 µM ITS 3 i ITS 4 (White et al. 1990), 1 u TaKaRa Taq Hot Start (Takara, Japan) i 0,5 µl izolirane DNA u razrjeđenju 1:100. Parametri amplifikacijskog ciklusa su bili sljedeći: početna denaturacija 5 min, 94 °C i 30 ciklusa: 1 min 95 °C, 1 s 56 °C i 1 min 72 °C te završni ciklus od 10 min, 72 °C. PCR reakcija umnažanja DNA dijagnostičkim početnicama je sadržavala 1x PCR pufer, 0,8 µg/µl BSA 0,5 uM početnica EpF i EpR (Piškur et al. 2007), 1 u TaKaRa Taq Hot Start (Takara, Japan) i 0,5 µl izolirane DNA u razrjeđenju 1:100. Parametri amplifikacijskog ciklusa su bili sljedeći: početna denaturacija 85 s, 94 °C i 35 ciklusa: 35 s, 95 °C; 55 s 60 °C i 1 min 72 °C te završni ciklus od 10 min, 72 °C. Sve PCR reakcije provedene su s negativnom kontrolom koja je sadržavala ultračistu vodu umjesto DNA. Umnažanje DNA fragmenata provedeno je u ukupnom volumenu od 10 µl u uređaju PTC-100 (MJ Research, USA). PCR produkti provjereni su elektroforezom na 1,8 % agaroznom gelu obojanom GelStar Nucleic Acid Gel Stain, (Lonza Rockland, Inc. Rockland, USA) u 1x TBE pufer pH 8,0 i DNA markerom Tracklt 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, Germany) i UV svijetlom. Umnožena DNA je pročišćena iz agaroznog gela korištenjem kompleta PureLink Quick gel Extraction kit (Invitrogen, Germany). Automatsko sekvencioniranje je izvedeno pomoću kompleta BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) na instrumentu 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Analiza sekvenci provedena je usporedbom sekvenci DNA prisutnih u GenBank (NCBI, Bethesda, MD, USA) koristeći program BLAST (Basic Local Aligment Search Tool).

ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 53     <-- 53 -->        PDF

REZULTATI I DISKUSIJA
Results and discussion
Pregledi šumskih sastojina sa prisutnošću stabala javora obavljeni su na 2011., 2012. i 2013, godine na 13 lokacija, a 2014. na 14 lokacija (Tablica 1). Godine 2011. i 2012. nije pronađeno niti jedno stablo javora zaraženo rakom kore. Godine 2013. pronađeno je u blizini mjesta Hum na Sutli uz Slovensku granicu (Šumarija Krapina, Gospodarska jedinica Pregrada-Klanjec, odjel 2e) jedno zaraženo stablo gorskog javora (A. pseudoplatanus). Stablo se nalazilo u mješovitoj sastojini bukve, kitnjaka, graba, cera, kestena i javora. Godine 2014. u mjestu Lupinjak u blizini Huma na Sutli uz slovensku granicu u privatnoj šumi pronađeno je jedno zaraženo stablo poljskog javora (A. campestre). Oba zaražena stabla imala su stari rak. Ukupno je pregledano 2209 stabala javora (Acer spp.).

ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 54     <-- 54 -->        PDF

U Tablici 2. prikazani su lokaliteti i koordinate na kojima su nađena stabla javora zaraženih rakom kore. Stablo gorskog javora (A. pseudoplatanus) starosti 69 godina, prsnog promjera 49 cm imao je rakastu tvorevinu na visini 5 m. Rakasta tvorevina bila je široka 46 cm a visoka 50 cm. Na poprečnom presjeku stabla kroz centar raka vidljivo je da je jedna trećina presjeka zahvaćena procesom truleži koja se širi od središte raka (Slike 2. i 3.). Stablo poljskog javora (A. campestre) starosti 37 godina, prsnog promjera 35 cm imao je rakastu tvorevinu na visini 3,5 m. Rakasta tvorevina bila je široka 37 cm i visoka 44 cm. Na poprečnom presjeku stabla kroz središte raka vidljivo je da su dvije trećina presjeka zahvaćene procesom truleži koja se širi od središta raka (Slike 3. i 4.). Prema Moorman (2012) mlađa stabla su osjetljivija na zarazu gljivom E. parasitica. Prema poprečnom presjeku vidljivo je da je na starijem stablu A. pseudoplatanus gljiva sporije prodirala u tkivo drva, dok je na mlađem stablu A. campestre gljiva brže prodirala u tkivo drva. Procijenjena starost raka, uzimajući u obzir veličinu rakaste tvorevine i brzinu rasta raka (1,5 do 2 cm godišnje prema Koetter i Grabowski, 2015), na stablu A. pseudoplatanus iznosi oko 27 godina i na stablu A. campestre oko 23 godine.
Na oba stabla ulazno mjesto infekcije je odlomljena trula grana oko koje se širi zaraza u okolno tkivo, što se vidi na poprečnom presjeku. Gljiva je razvila micelij ispod kore, prorasla je i razorila stanice bjelike i kambija i širi se u srčiku. Ispod kore pronađen je karakteristični bijelokremasti lepezasti micelij (Slika 6.).
Makro i mikro analizom kore u središnjem dijelu raka utvrđena su plodna tijela, strome s crnim peritecijima te slobodni crni periteciji. U peritecijima su bili vidljivi askusi s askosporama. Veličina izmjerenih 30 askospora iznosila je 6,15-11,13 (7,93) µm x 2,18-3,85 (2,86) µm, što odgovara izmjerama Ogris et al. (2008). Na prerezu trupčića s rakastom tvorevinom na prijelazu bolesnog u zdravo tkivo razvio se bijeli gusti micelij gljive E. parasitica tri mjeseca nakon držanja u uvjetima opisanim u metodama (Slika 7.).
Izolacijom gljive iz komadića drva s prijelaza bolesnog u zdravo tkivo na PDA hranjivoj podlozi u petrijevim zdjelicama

ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 55     <-- 55 -->        PDF

dobivena je kultura gljive gustog bijelog micelija istovjetna miceliju koji se razvio na prerezanom trupčiću (Slika 8.).
Na temelju morfoloških karakteristika koje su utvrđene laboratorijskim ispitivanjima, a odgovaraju opisima Ogris at el. (2008) i Cech (2007), utvrđena je vrsta E. parasitica. Da bi se sa sigurnošću moglo potvrditi nalaz gljive E. parasitica uzorci zaraženog drva i kulture gljive proslijeđeni su na molekularnu analizu i detekciju.
Molekularnom analizom PCR metodom i dijagnostičkim početnicama provedena je analiza zaraženog tkiva drveta dva uzorka uzeta s gorskog javora i klena, kao i kulture gljiva koje su nastale iz ta dva uzorka drveta. Sva četiri uzorka DNA umnožena s dijagnostičkim početnicima dali su pozitivan rezultat. Umnoženi su fragmenti DNA istovjetne veličine (Slika 9.), što odgovara veličini fragmenta DNA od 341 pb umnoženim s istim početnicama navedenim u članku Piškur et al. (2007). Fragmneti DNA su sekvencirani te je napravljena usporedba u genskoj bazi podataka (GenBank, NCBI), gdje je potvrđeno da se radi o 100 % istovjetnosti s E. parasitica.
ITS 2 regija E. parasitica iz dva uzoraka zaraženog stabla umnožena je s ITS3 i ITS4 početnicama i sekvencirana. Sekvence DNA su prijavljene u gensku banku (GenBank, NCBI) pod pristupnim brojevima KP868619 i KP868620. Uspoređivanje ITS2 regije ovih dviju DNA sa sekvencama pohranjenim u genskoj banci pokazalo je 99-100 % istovjetnosti sa sekvencama ITS2 regija gljiva E. parasitica iz Slovenije koje su pohranili Piškur et al. (2007) i Jurc et al. (2006). Pohranjene slovenske sekvence izolirane su iz E. parasitica s tri različita domaćina: A. platanoides (AM295773), A. pseudoplatanus (AM295770, AM295776 DQ11896) i A. campestre (AM295774, AM295772).
Fitopatološka i DNA analiza potvrdile su zarazu na samo dva stabla javora od ukupno pregledanih 2209. Javorova stabla u šumskim sastojinama u Hrvatskoj dolaze pojedinačno ili u manjim grupama. Takva struktura šumskih sastojina usporava pojavu širenja zaraze rakom kore javora. Osim toga na širenje zaraze bitno utječe i biologija gljive. Plodna tijela formiraju se 5 do 8 godina nakon početne infekcije, periteciji otpuštaju askospore samo u izravnom kontaktu s vodom (Lachance 1971). Osim toga, askospore se šire maksimalno 25 m u dužinu i 4 m u visinu (Johnson i Kuntz 1979 u Cech 2007).
E. parasitica utvrđena je u Hrvatskoj 2007. godine samo na stablima vrste A. campestre (Ogris et al. 2008.). Pregledom stabala javora 2013. gljiva E. parasitica prvi puta je utvrđena u Hrvatskoj na stablu A. pseudoplatanus.
Rezultati istraživanja upućuju da se zaraza od prvog mjesta nalaza ne širi na druga područja. S obzirom da je zaraza teško vidljiva prvih godina raka (EPPO RS 2008/028), zbog sigurnosti i očuvanja trenutnog stanja pod kontrolom nastavlja se provođenje programa Posebni nadzor raka kore javora.
ZAKLJUČAK
Conclusion
Utvrđeno je da je zaraza gljivom E. parasitica u Hrvatskoj od 17 mjesta pregleda na 8 županija nađena samo u 1 županiji, Krapinsko-zagorskoj, na dva lokaliteta u općini Hum na Sutli u blizini slovenske granice. Nakon prvog nalaza 2007. godine, a za vrijeme 4 godišnjeg pregleda šumskih sastojina s javorom, nađeno je 2013. i 2014. godine po jedno zaraženo stablo (A. pseudoplatanus i A. campestre). Pregledom stabala javora 2013. gljiva E. parasitica prvi puta je utvrđena u Hrvatskoj na stablu gorskog javora (A. pseudoplatanus).
Od ukupnog broja pregledanih stabala 2209 kom., u tom razdoblju nađena su dva zaražena stabla, što iznosi 0,09 %.

ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 56     <-- 56 -->        PDF

Razlog slabog intenziteta zaraze je mala zastupljenost javora u šumskim sastojinama, stablimičan raspored i raspored stabala u malim grupama. Formiranje plodnih tijela peritecija je spor proces (potrebno je 5 do 8 godina od početka infekcije), za otpuštanje askospora iz plodnih tijela potreban je izravan kontakt s vodom tj. kišom, a širenje askospora je na kratku udaljenost, do 25 m. Gljiva E. parasitica detektirana je klasičnom morfološkom fitopatološkom metodom i modernom molekularnom metodom. Molekularna detekcija potvrdila je vrstu gljive E. parasitica. Dvije sekvence ITS2 regije gljive E. parasitica prisutne na zaraženim stablima pohranjene su u gensku banku (GenBank, NCBI) pod pristupnim brojevima KP868619 i KP868620.
ZAHVALE
Acknowledgements
Zahvaljujemo se svim djelatnicima Hrvatskih šuma i šumarskoj inspekciji koji su sudjelovali pri terenskim radovima, kao i Ministarstvu poljoprivrede koje financira Program Posebni nadzor Eutypella parasitica.
LITERATURA
References
Cech, T., 2007: Erstnachweis von Eutypella parasitica in Österreich. Forstschutz Aktuell 40: 10 – 13., http:www.waldwisen.net/waldwirtschaft/schaden/piltze-nematoden/bfw
Database of fungal names, http://indexfungorum.org/names/Names.asp.strGenus=Eutypella
Doyle, J.J., J.L., Doyle, 1987: A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue, Phytochem Bull, 19:11-15.
EPPO, 2006: Alert list, EPPO RS 2005/176, 2006/143. http://wHYPERLINK "http://www.eppo.org/QUARANTINE/Alert_List/fungi/ETPLPA.htm" ww.eppo.org/QUARANTINE/Alert_List/fungi/ETPLPA.htm
http://www.eppo.org/QUARANTINE/Alert_List/fungi/ETPLPA.htmEPPO, 2006: Reporting service no. 07-2006, Num. Article 2006/143. Current situation of Eutypella parasitica in Slovenia. https://archives.eppo.int/EPPOReporting/2006/Rse-0607.pdf
EPPO, 2008: Reporting service 2008/028 http://wHYPERLINK "http://www.eppo.int/Eutypella parasitica.doc" ww.eppo.int/Eutypella parasitica.doc
http://www.eppo.int/Eutypella parasitica.doc Hudler, G. W, 1984: Disease of Maple in Eastern North America. Cornell Cooperative Extension Publication. Cornell Tree Pest Leaflet A-13, http://maple.dnr.cornell.edu/pubs/diseases/bark.htm
Johnson, D. W., J.E., Kuntz, 1979: Eutypella canker of maple: Ascospore discharge and dissemination. Phytopathology 69: 130-135.
Jurc, D., N., Ogris, B., Slippers, J., Stenlid, 2006: First report o f eutypella canker of Acer pseudoplatanus in Europe. New Disease Reports, http://wHYPERLINK "http://www.bspp.org.uk/ndr/jan2006/2005-99.asp" ww.bspp.org.uk/ndr/jan2006/2005-99.asp
http://www.bspp.org.uk/ndr/jan2006/2005-99.aspKoetter, R., M., Grabowski, 2015: Eutypella Canker. University of Minnesota. http://www.extension.umn.edu
Lachance, D., 1971: Discharge and germination of Eutypella parasitica ascospores. Canadian Journal of Botany 49(7): 1111-1118.
Liović, B., 2012: Rak javorove kore (Eutypella parasitica Davidson & Lorenz) u Hrvatskoj. Radovi 44(2): 153-157.
Moorman, G.W., 2012: Eutypella canker on maple. Plant disease fact sheet. Penn State Extension, Penn State University College of Agricultural Sciences. http://extension.psu.edu/plant-disease-factsheets/all-fact-sheets/eutypella-canker-on-maple.
Ogris N, D., Jurc, M., Jurc, 2006: Spread risk of Eutypella canker of maple in Europe. EPPO Bulletin 36, 475-485.
Ogris N., D., Diminic, B., Piškur, H., Kraigher, 2008: First report of Eutypella parasitica causing cankers on field maple (Acer campestre) in Croatia, New Disease Reports 16, 39. Plant pathology 57 (4): 785-785.
Piškur B, N., Ogris, D., Jurc, 2007: Species-specific primers for Eutypella parasitica, the causal agent of Eutypella canker of maple, Plant Disease 91, 1579-1584.
Program posebnog nadzora Eutypella parasitica Davidson & Lorenz rak kore javora, 2011., 2012., 2013., 2014., Ministarstvo poljoprivrede, Zagreb
White, T. J., T., Bruns, S., Lee, J. W., Taylor, 1990: Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, PCR protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, Inc., 315–322. New York, N.Y
Summary
Fungus Eutypella parasitica is cause of bark canker on on maple trees. The disease reduces the economic and aesthetic value of maple. In Europe, the Eutypella canker was first recorded in Slovenia in 2005. From 2005 to 2008 the disease was listed on the EPPO Alert List because of the danger of contagion. In Croatia, Eutypella canker was recorded for the first time in 2007 on A. campestre near the border with Slovenia. The program Special monitoring of fungus E. parasitica was carried out since 2011 in Croatia. The aim of this study was to determine the status of infection on maples seven years after it was recorded for the first time, spread of the disease and infection intensity in Croatia. The second objective was to confirm the type of fungus using phytopathological and molecular analysis and store the DNA sequence of ITS2 region in GenBank (NCBI). The forest stands that represent maple trees in the area of 8 counties and 17 localities were examined in the period from 2011 to 2014. From a total of 2209 examined trees, only 2 trees of A. pseudoplatanus,and A. campestre, in the vicinity of settlement Hum na Sutli on the Slovenian border, were infected by the fungus, representing

ŠUMARSKI LIST 5-6/2015 str. 57     <-- 57 -->        PDF

only 0.09 % of infected trees. Eutypella canker was found with very low intensity and the disease has not spread to other sites. The samples of cankerous formations were submitted to laboratory analysis, morphological analysis, and DNA analysis to confirm the presence of fungi E. parasitica. Fragments of DNA were sequenced and compared with gene in databases GenBank (NCBI), where it was confirmed that it was a 100 % identity with the E. parasitica. ITS2 region fungus E.parasitica established as sycamore and chubs was sequenced and deposited in gene bank (GenBank, NCBI) under accession numbers KP868619 and KP868620. Fungus E. parasitica was recorded for the first time in Croatia on A. pseudoplatanus in 2013, and its presence was confirmed on A. campestre in 2014. Type fungus E. parasitica was confirmed by morphological and molecular DNA detection. Bark canker on maples has not been significantly expanded during the last seven years in Croatia.
KEY WORDS: Eutypella parasitica, Eutypella canker, Acer pseudoplatanus, Acer campestre, molecular diagnostic, ITS2 region