DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu



ŠUMARSKI LIST 11-12/2012 str. 29     <-- 29 -->        PDF

U Hrvatskoj, nažalost, do sada nije bilo znanstvenih istraživanja maruna koji se uzgajaju na lovranskom području te nije poznato s kojim su biljnim materijalom nasadi podignuti, odnosno koliko je različitih genotipova zastupljeno pod nazivom "lovranski marun". Ta saznanja su ključna za sve daljnje korake koje treba poduzeti kako bi se očuvali postojeći genetski izvori (Liber i dr. 2009, Idžojtić i dr. 2010b). Cilj ovoga istraživanja bila je analiza genetske raznolikosti stabala lovranskog maruna u postojećim nasadima.
Materijal i metode
Material and Methods
Izolacija DNK, amplifikacija, detekcija mikrosatelita – DNA Extraction, PCR Amplification and Microsatellite Genotyping
Za analizu genetske raznolikosti, krajem proljeća i početkom ljeta 2008. godine, uzorkovana su 72 stabla maruna na području Općine Lovran. Stabla se nalaze u privatnim nasadima na lokalitetima Liganj, Dobreć, Lovranska Draga i u blizini tunela Učka. Od ukupnog broja uzorkovanih stabla 70 je bilo cijepljenih, a dva nisu cijepljena ("kostanji" uzgojeni iz sjemena), ali se nalaze u nasadima pored maruna i s njih se također sakupljaju plodovi. Sva su uzorkovana stabla označena brojevima i geopozicionirana. Prsni promjer stabala bio je od 32 do 140 cm.
Od stabala, određenih za molekularnu identifikaciju, sakupljeni su listovi, te je u svrhu izolacije DNK izvagano 100 mg svježeg lisnog tkiva svake istraživane jedinke. Izolacija ukupne stanične DNK provedena je pomoću DNeasy® Plant Mini DNA izolacijskog kompleta (Qiagen®), prema uputama proizvođača.
Budući da su SSR biljezi u dosadašnjim studijama genetske raznolikosti kultivara pitomog kestena pokazali visoku informativnost i zadovoljavajući stupanj polimorfizma, primijenjeni su i u ovom istraživanju. Kako bi se odredila zastupljenost pojedinih kultivara u cjelokupnom uzorku, korišteno je pet mikrosatelitnih biljega iz grupe CsCAT, kao što je prikazano u Tablici 1 (Marinoni i dr. 2003).
Umnožavanje mikrosatelitnih regija lančanom reakcijom polimerazom provedeno je u uređaju GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems®), i to prema Marinoni i dr. (2003). Umnoženi mikrosateliti detektirani su pomoću kapilarne elektroforeze (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer). Ukupno 1,5 μl umnoženih mikrosatelitnih produkata nakon lančane reakcije polimerazom smješteno je u PCR ploče s 96 epruveta (72 uzorka), a zatim je svaki uzorak pomiješan s 10 μl formaldehida i 0,5 μl DNK standarda Rox 500 (Applied Biosystems®). Uzorci su tri minute denaturirani na 95 °C te neposredno nakon toga smješteni na led. Nakon kapilarne elektroforeze fragmenata DNK rezultati svih analiziranih uzoraka bili su vidljivi u obliku .fsa podataka. Pregledavanje .fsa podataka i određivanje mikrosatelitnih alela izvršeno je pomoću programa GeneMapper® 4.0 (Applied Biosystems®).
Statistička analiza – Data Analysis
U svrhu procjene raznolikosti mikrosatelitnih biljega izračunat je ukupan broj alela po biljegu (Na), zapažena heterozigotnost (Ho), očekivana heterozigotnost (He) te informacijski sadržaj polimorfizma (PIC). Navedeni parametri izračunati su pomoću računalnih programa PowerMarker V3.23 (Liu 2002) i FSTAT v. 2.9.3.2. programme package (Goudet 1995, 2002).