DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2011 str. 12 <-- 12 --> PDF |
T. Jakovljević, M. Gradečki-Poštenjak1, I. Radojčić Redovniković: FIZIOLOŠKA, KEMIJSKAI ... Šumarski list br. 7–8, CXXXV (2011), 343-352 provodi ispitivanja i razlikuju se u veličini od metode do metode (ISTARules, 2010.) Kemijski sastav sjemena–Chemicalcomposition ofseed Za određivanje kemijskog sastava i antioksidativne aktivnosti na sjemenkama pinije odvojeni su posebno: unutarnja sjemenska ljuska i sjeme. Prije mljevenja uzorci su sušeni 24 sata na 80°C, samljeveni do veličine 0,20 mm na mlin IKAM10 (UN EC ICP, 2007).Za potrebe određivanje fosfora, kalija, kalcija, magnezija, cinka, bakra, željeza i manganaodvagano je 0, 50 g uzoraka te je provedena digestija sa 96% sulfatnom kiselinom, uz dodatak par kapi 60 % perklorne kiseline pri sobnoj temperaturi (UN EC ICP, 2007). Ukupni fosfor određen je na UV/VIS spektrofotometru PE Lambda 1A pri apsorpcijskom maksimumu od 890 nm. Količina kalija, kalcija, magnezija, cinka, bakra, željeza i mangana određena je na atomskom apsorpcijskom spektrofotometru PE (Perkin-Elmer,1999). Na elementarnom analizatoru SC 132 određena je količina sumpora,a na elementarnom analizatoruCNS 2000 određena je količina dušika i ugljika (Leco, 2000). Analiza je provedena suhim spaljivanjem uzoraka bez prethodne kemijske pripreme tzv. “elementarnom analizom”(ISO 10694, 1995). Spaljivanje uzoraka na elementarnim analizatorima provedenojepri temperaturi od 1350 °C u struji kisika analitičke čistoće (Leco,2002). Sirovi proteini utvrđeni su na osnovi količine ukupnog dušika umnožene specifičnim konverzijskim faktorom tzv. “Jones faktor”. Količina sirovih proteina izračunata je korištenjem konverzijskog faktora. Kad specifičan faktor nije poznat, općenito se koristi konverzijski faktor 6.25 (FAO, 2007).Rezultati su prikazani kao srednje vrijednosti dvaju ponavljanja ± standardna devijacija (Miller i Miller,2005). Ekstrakcija polifenola –Extractionofpolyphenols Za ekstrakciju polifenola formirani su uzorci sjemena pinije na način da je odijeljena unutarnja sjemenska ljuska od sjemena (embrija i endosperma). Uzorci (unutarnja sjemenskaljuska i sjeme)su sušeni, samljeveni te odmašćeni.Provedena je trostruka ekstrakcija s heksanom (1:5 w/v, 15 min × 3) pri sobnoj temperaturi, -1 a zaostali talog centrifugiran 10 min pri 5000 ° min (Hettich Zentrifugen EBA20, Germany). Supernatanti su oddekantirani i odbačeni, a dobiveni talozi su prosušeni na sobnoj temperaturi kroz 12 h. Za ekstrakciju polifenolnih spojeva upotrjebljeno je 0,50 godmašćenog uzorkaljuske (DPPS) i jezgre(DPPK), a ekstrakcija je provedena sa 70 % metanolom (5 mL× 2)kroz 15 min. Ekstrakt je centrifugiran 10 min pri 5000 ° min-1,a supernatanti su spojeni i razrjeđeni do 10 mLsa 70 % me tanolom i spremljeni u hladnjak na–18 °C i čuvani do daljnje analize (Mazor Jolići sur., 2011). Određivanje ukupnih polifenola –Determination oftotal phenolics Spektrometrijsko određivanje ukupnih polifenola pomoću Folin-Ciocalteau reagensa provedeno je prema metodi koju su opisali Singleton i Rossi (1995). Na 0,50mLpolifenolnog ekstrakta dodano je 2,50mLFC reagensa razrijeđenog 10 puta i potom ostavljeno stajati 5 min. Zatim je dodano mLNaCO (75g L ) i sve se zagrijavano 5 min pri 50 °C. Reakcija jebrzo zaustavljena u ledenoj kupelji te je na UV/VIS spektrofotometru (Cary 3, Varian, Palo Alto, USA) izmjerena apsorbancija pri .=760nm. Za izračunavanje mase koncentracije polifenola korištena je galna kiselina (pet 23 -1 točka za baždarnu krivulju, 10 - 50 mg L galne kiseline u 70 % metanolu). Dobiveni podaci mjerenja izraženi su kao mg ekvivalenta galne kiseline po gramu odmašćenog uzorka sjemenaPine pineaL. Određivanje antioksidacijske aktivnosti ORACmetodom– AntioxidantactivitydeterminedbyORAC assay Antioksidacijske aktivnosti ORAC-metodom određena je prema metodi Cao i sur. (1993). Otopina za mjerenje (3 mL) sadrži:2,25 mL0,04 mM fluoresceina u 0,075 M fosfatnom puferu (pH 7,0) i 0,375 mLrazrijeđenog uzorka. Otopine su inkubirane 30 min pri 37 °C. Nakon 30 min dodan je 0,375 mL152 mMAAPH [2,2azi nobis (2-amidinopropane) dihydrochloride]. Mjerenja su provedena spektrofluorimetrom Cary Eclipse Spectrofluorimeter (Varian, PaloAlto, USA) pri l = 485 ekssitacije nm i l = 520 nm pri 37 °C, a promjena intenziteta emmisije fluorescencije mjeri se svaku minutu. Za slijepu probu 1 umjesto uzorka dodano je 0,375 mL0,075 M fosfatnog pufera. Standard za kalibracijsku krivulju za određivanje ORAC-vrijednosti je Trolox. Iz pripremljene 0,5 mM otopineTroloxa pripravljena su 6 razrjeđenja. Mjerenja ORAC-vrijednosti provedena su na isti način kao i za uzorak. ORAC vrijednost izračunata je prema formuli: Relativna ORAC vrijednost = ( )xkxaxh(1) -1 [µmolTrolox ekvivalent g uzorka] . AUC=0,5+(R/R)+(R/R)+……..+(R+R) (2) 2131 n1 . AUC = antioksidacijski kapacitetuzorka U . AUC = antioksidacijski kapacitet slijepe probe SP . AUC =antioksidacijski kapacitetTroloxa TRX . k = faktor razrjeđenja . a = molarna koncentracijaTroloxa . h = |