DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 25     <-- 25 -->        PDF

STRUČNI ČLANCI PROFESSIONAL PAPERS Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
UDK 630* 165


MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.)


MICROPROPAGATION OF WHITE POPLAR (Populus alba L.)


Bojana PINTARIĆ*


SAŽETAK: Kultura je multiplicirana iz nodalnih segmenata i vrhova
sterilnih izbojaka bijele topole (Populus alba L.) na osnovnoj podlozi: modificiranoj
podlozi Woody Plant Medium (WPM; MS /Murashige i Skoog/ –
makroelementi, WPM – mikroelementi i vitamini) uz dodatak 0,25 ili 0,5 mg/l
BA (6-benziladenin). Stopa multiplikacije izbojaka na ovim podlogama bila
je različita i iznosila je 5,36 po eksplantatu za M1 podlogu, tj. 5,86 za M2
podlogu u toku prvih pet pasaža. Međutim, u idućim pasažama došlo je do
jasnog odvajanja linija, te se broj novih izbojaka po eksplantatu na podlozi
M1 smanjio na prosječnih 1,8; dok se na podlozi M2 povećao na 13,45 po
eksplantatu.


Stopa rasta biljnog materijala bijele topole, u uvjetima in vitro, bila je
proporcionalna stopi multiplikacije na oba tipa podloga za multiplikaciju.
Međutim, na podlozi M1 je u prvih pet pasaža stopa biljnog rasta bila izraženija
u odnosu na podlogu M2, gdje se taj odnos vrlo brzo i jasno u iduće tri
pasaže promijenio, tako da se za dugotrajniju uporabu ovih eksplantata u
uvjetima kulture in vitro podloga M2 pokazala kao bolja.


Izolirani izbojci, veličine oko 3–4 cm, u uvjetima su se in vitro 100 % zakorjenili
pri tretmanu zasađivanja na podlogu za zakorjenjivanje (Z) uz dodatak
0,1 mg/l IBA (indolbuterna kiselina) u trajanju od sedam dana i njihovog presađivanja
na osnovnu podlogu bez hormona (BH) iduća tri tjedna. Ovako zakorijenjene
individue uspješno su preživjele prijenos u sterilni zemljišni supstrat
(zemlja i pijesak u omjeru3:1) i aklimatizaciju u uvjetima in vivo.


Ključne riječi: Populus alba L. i mikropropagacija


1
11. UVOD – Introduction
1.2. Kultura in vitro i tipov
tipovtipovi
ii kultura – Culture in vitro and the tipes of cultures
Kultura in vitro je postupak koji podrazumijeva rast vrste. Bez sumnje, to je proces kloniranja, jer sve proizvrlo
sitnih organa, komadića tkiva ili izoliranih stanica vedene biljke predstavljaju matične kopije razmnožeu
aseptičkim (sterilnim) uvjetima. Sam naziv kultura in nog majčinskog uzorka (Međedović 2003).
vitro označava uzgoj kultura u staklu ili prozirnim Postupci kulture in vitro mogu biti primijenjeni u
posudama. Ovaj način razmnožavanja biljaka često se raznim biotehnočoškim i genetičko-inžinjerskim zanaziva
mikrorazmnožavanje, jer su biljni organi ili cijehvatima
u smislu očuvanja i zaštite genofonda neke
le biljke, u odnosu na generativnu proizvodnju, u miniugrožene
vrste, razmnožavanja genetički superiornijih
jaturnim dimenzijama. Sam postupak osigurava vrlo stabala, žalosnih formi drveća i grmlja, oblika otpornih


brz proces dobivanja velikog broja serija biljaka, koje na kemijski stres, zagađenost atmosfere, otpornost pre


su istovjetne po razvoju, rastu i genetičkom potencijalu ma određenim pesticidima i herbicidima, itd. Kultura
in vitro predstavlja najmoćnije oruđe moderne genetike
i molekularne biologije u cilju israživanja rasta i
razvoja biljaka, te njihove biokemije i fiziologije se


* Dipl. ing. hort. Bojana Pintarić
kundarnih metabolita (Međedović 2003).


Ante Babića 3, Sarajevo




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 26     <-- 26 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
Postoje različiti pristupi u klasifikaciji tehnika kulture
biljaka u uvjetima in vitro. Tehnike se mogu dijeliti
ili po tipu eksplantata koji se uvodi u kulturu (ćelije,
organi, tkiva) ili po namjeni (haploidi, somatska embriogeneza,
somaklonarno variranje, itd.), što je predstavljeno
na shemi br. 1. (Vi n t e r h a l t er et Vi nt erh
a l t er 1996).


Tri kronološki najstarije in vitro tehnike kod biljaka
su: kultura tkiva (stanica), kultura embriona i kultura
korijenova. Iako su odigrale važnu ulogu u općem
razvoju tehnike kulture in vitro, na njima se danas vrši
razmjerno malo istraživanja.


Shema 1. Tipovi eksplantata koji se koriste za pokretanje in vitro kultura (Vinterhalter et Vinterhalter 1996).
Sheme 1 The types of explantants which are used for in vitro cultures initiation


1.2.1. Tipovi kulture in vitro
Višestanični biljni organizam izgrađuju različiti tipovi
stanica i diferenciranih tkiva. S tim u vezi postoje
i različiti tipovi kultura koje se imenuju prema organu,
odnosno tipu tkiva početnog eksplantata. Tako se prema
vrsti eksplantata razlikuju:
a) Kultura cijelih (intaktnih) biljaka,
b) Kultura embrija,
c) Kultura korijena,
d) Kultura antera,
e) Kultura meristema,
f) Kultura apikalnog i aksilarnog pupa i
g) Kultura pojedinačnih nodija.


Ako se krene od definicije kulture in vitro, kao zajedničkoga
nazivnika manipulacije biljnim uzorkom u
sterilnim uvjetima, važnost definicije odnosi se samo
na, u užem smislu riječi, kulturu neorganiziranih naku


– Tipes of culture in vitro
pina stanica, tj. kalusa. Međutim, uporabom eksplantata
vršnog meristema izdanka stabla ili korijena procesi
razvoja i diferencijacije bit će nastavljeni u istom smijeru
(formiranjem izbojka ili korijena), što predstavlja organizirani
rast. S druge strane, procesi proliferacije mogu
biti usmjereni na kalusiranje, gdje se stanice umnožavaju
bez inputa diferencijacije (neorganiziran rast).


Organiziran rast u kulturi in vitro nastaje proliferacijom
početnog eksplantata u smjerovima koji su genetički
determinirani u početnom biljnom uzorku. Uz vršne
meristeme, organizirani rast nastavljaju i aksilarni meristemi,
lisni zameci, mladi cvijetni pupovi i sl.


Neorganiziran rast javlja se kod eksplantata koji ne
sadrže niti jednu poznatu strukturu iz biljnog organizma
ili su s ograničenim brojem različito diferenciranih stanica.
Ovom tipu kulture pripadaju (Međedović 2003):




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 27     <-- 27 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
a) Tkivna kultura (kalus), c) Kultura pojedinačnih stanica (kultura polena) i
b) Kultura stanica u suspenziji, d) Kultura protoplasta.


1.3. Mikropropagacija drvenastih vrsta – Micropropagation of woody species
Mikropropagacija je postupak u kojemu se za kultiviranje
koriste isključivo izbojci stabla osovinskog porijekla,
tj. vršni i pazušni pupoljci (Vi nte r h a l t e r &
Vinterhalter 1996). Postupak se zasniva na dodavanju
egzogenih citokinina s ciljem aktiviranja postojećih
pazušnih pupoljaka, odnosno izazivanja izduživanja njihovih
internodija i formiranja listova, a zatim i novih
pupoljaka u njihovom pazuhu.


Karakteristika metode je u tome da se kulture održavaju
kao tzv. “kulture izbojaka”, koje u načelu nemaju
korijenov sustav, sve dok se za tim ne ukaže potreba.
Za podsticanje ožiljavanja koristi se podloga drukčijeg
sastava, obično s auksinima, a eksplantati u ovoj fazi
pojedinačni su izbojci isječeni s busenova, koji nakon
ožiljavanja predstavljaju pojedinačnu individualnu
biljku – rasad.


Postupak mikropropagacije razrađen je u prvoj polovici
70-ih godina na voćnim vrstama, a posebno na
jagodama i podlogama za razne vrste roda Prunus. Pojava
mikropropagacije bila je trijumf primjene metoda
in vitro u klonskom razmnožavanju biljaka. Ona je
omogućila izuzetno veliku brzinu razmnožavanja, i to
tijekom cijele godine, u laboratorijskim uvjetima u kojima
je moguće osigurati apsolutnu kontrolu uvjeta
rasta i zdravstvenog stanja kultura. U kombinaciji s eliminacijom
virusa, putem termoterapije i kulture meristema,
mikropropagacija je ponudila skoro savršeno
rješenje za savremenu rasadničku proizvodnju.


Prvi rezultati bili su povoljni, jer je pokazano da
biljke proizvedene ovom kontinualnom kulturom meristema
i pupoljaka u potpunosti zadržavaju svoja
klonska svojstva i da se ni na koji način ne razlikuju od
biljaka proizvedenih klasičnim postupcima. Također,
objavljeni su radovi za razne, posebice voćne vrste u
kojima je dokazano da su po nizu parametara koji definiraju
kvalitetu ne samo sadnica već i plodova, biljke
iz epruvete superiornije nad biljkama proizvedenim
konvencionalnim putem.


Nešto kasnije pojavljuju se i suprotna mišljenja, posebno
kada je u pitanju dobivanje i proizvodnja podloga
oslobođenih od virusa (virus-free) za različite vrste,
kod kojih je primijećena promjena (opadanje) sposobnosti
ožiljavanja nakon oslobađanja od virusa.


Iako se o tome nije puno pisalo, znalo se da korištenje
kalusa i uopće in-vitro tehnika može izazvati pojavu
aberantnih (off-type) biljaka, što je krajnje nepoželjno
u rasadničkoj proizvodnji, odnosno klonskom
razmnožavanju. Međutim, početkom 1980-ih godina
prošloga stoljeća L a r ki n i S c o wc r o f t (Vi n t e r ha
lt er i Vi n t e r ha l t e r ) ukazali su da varijabilnost


nastala tijekom ili kao posljedica korištenja metode
kulture in vitro može biti korisna u selekciji i oplemenjivanju.
Posebnost je dobila ime “somaklonalno variranje”,
pod kojim se podrazumijevaju samo one promjene
izazvane u kultiffi in vitro koje postaju nasljedne.
Bolje rečeno, samoklonalno variranje je rezultat
promjene genotipa, a ne fenotipa. Međutim, metode
kulture in vitro izazivaju i fenotipske, epigenetske, odnosno
prolazne promjene, koje su za klonsko razmnožavanje
neželjene, jer nužno nalažu detaljno ispitivanje
prirode i uzroka svoga nastanka.


U šumarstvu metode kulture in vitro našle su primjenu
i za klonsko razmnožavanje i u selekciji superiornih
individua. Mikropropagacija može se koristiti
kod čitavog niza dikotiledonih širokolisnih šumskih
vrsta, kao što su topole.


Drvenaste vrste su puno zahtjevnije i teže se kultiviraju
u uvjetima in vitro od zeljastih biljaka, zbog sljedećih
razloga:


1) Drvenaste vrste imaju slabiju regeneracijsku mo


gućnost u usporedbi sa zeljastim biljkama,
2) Rejuvenilizacija kod drveća je, općenito teža,
3) Stopa umnožavanja mnogo je niža kod drvenastih


vrsta, što je povezano njihovim dugotrajnim životnim
ciklusom i
4) Drvenaste vrste podložnije su izlučivanju toksičnih
tvari u hranjivu podlogu, itd. (J e 1 a s k a 1994).


Potrebno je napomenuti da osim primjene u rasadničkoj
proizvodnji, klonsko razmnožavanje biljaka
metodama kulture in vitro ima značajnu primjenu gdje
god se radi selekcija i oplemenjivanje. Mikropropagacija
i regeneracija izbojaka teme su za istraživanje i uspješnu
primjenu genetičkog inženjeringa kod biljaka.


Mikropropagacija primjenjuje se kod:
> Brzog razmnožavanja novih genotipova,
> Čuvanja (održavanja) interesantnih genotipova,
> Ubrzanja, skraćivanja ili dovršavanja postupaka se


lekcije i oplemenjivanja te
Č Regeneracije izbojaka i cijelih biljaka u genetičkom
inženjerstvu.


U tablici 1. dana su dva široko rasprostranjena sustava
za mikropropagaciju i klonsko razmnožavanje. Jedan
od sustava predložio je Murashig e i on obuhvaća
ne samo mikropropagaciju u užem smislu (samo iz
aksilamih izbojaka), već sve sustave u kojima se kao
rezultat in vitro kultiviranja mogu dobiti izbojci. Ovaj
sustav pogodan je pri istraživačkom radu.


Iz prijedloga Debergh i Maene može se zamijetiti
da se ožiljavanje izbojaka ne vrši u uvjetima in




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 28     <-- 28 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
vitro, već se u međufazi IIIa izbojci izdužuju, a potom reznice. Ovaj sustav pogodan je za masovno klonsko
isijecaju i postavljaju u zemljišni supstrat kao i zelene razmnožavanje.


Tablica 1. Faze mikropropagacije biljnog materijala (Vinterhalter et Vinterhalter 1996).
Table 1 Phases of micropropagation of the plant material (Vinterhalter et Vinterhalter 1996).


Operacija Murashige, 1974. Debergh i Maene, 1981.
Priprema, sakupljanje i transport materijala Faza I Faza 0
Površinska sterilizacija Dobivanje kulture bez očiglednih Higijenski uzgoj biljaka s kojih se
Postavljanje primarnih eksplantata zaraza; zadovoljavajući postotak uzimaju eksplantati
u uvjetima in vitro preživjelih eksplantata u kulturi; Faza I
Provjera na zaraze (kontaminaciju) brz rast eksplantata Uspostavljanje aseptičnih kultura
Multiplikacija izbojaka Faza I I Faza I I


Adventivna organogeneza izbojaka Indukcija meristemskih centara,
Izduživanje izbojaka Stimulacija indukcije njihov razvoj u izbojke


aksilarnih izbojaka i multiplikacija
Ožiljavanje izbojaka Faza III a
Aklimatizacija sadnica Uniformno izduživanje izbojaka


Faza III Faza III b
Ožiljavanje izdanaka i -ex vitropresađivanje
u zemljište Isijecanje izduženih izbojaka, a


zatim ožiljavanje i
adaptacija tih reznica


2. CILJ ISTRAŽIVANJA – The research goal
Cilj istraživanja je uspostavljanje sustava brze multi- ove tehnologije u rasadničkoj proizvodnji i ujedno
plikacije, zakorjenjivanja i aklimatizacije eksplantata njena primjena kao modela, u okviru praktičnih vježbi
bijele topole (Populus alba L.) na različitim podlogama. predmeta Fiziologija drveća i Kultura in vitro.
Na ovaj način bi se omogućila eventualna primjena


3. MATERIJAL I METODE RADA Matherial and methods of work
3.1. Biljni materijal Plant matherial
U ovom pokusu biljni materijal su bili eksplantati
bijele topole (Populus alba L.) koji su uzgojeni u in
vitro uvjetima u Italiji, (Firenze Scienze e Tecnologie
Ambientali Forestali).


Slika 1. Izbojci bijele topole
Picture 1 Sprouts of white poplar


3.2. Autoklaviranje i sterilizacija – Sterilization
3.2.1. Površinska sterilizacija biljnog materijala – Surface sterilization of the herbal material
Površinska sterilizacija vrši se s ciljem da se sa po-lizacija treba biti dovoljno jaka, kako bi se eliminirali
vršine primarnog eksplantata biljke uklone mikroorgamikroorganizmi,
ali da istovremeno ne ubije i sam prinizmi,
koji bi prilikom uvođenja eksplantata u kulturu marni eksplantat.
in vitro mogli kontaminirati hranjivu podlogu. Steri




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 29     <-- 29 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.)
Površinska sterilizacija izvodi se tako da se vršni i
bočni izbojci isijecaju, smiještaju u odgovarajuće flašice
i tetiraju sredstvom za površinsku sterilizaciju. U tu
svrhu najčešće se koristi 10 % otopina varikine (ili drugog
komercijalnog izbjeljivača), koja sadrži 4–6 % Nahipoklorit.
Sterilizacija se vrši u Erlenmajer posudama,
ili drugim pogodnim staklenim flašicama, koje se prethodno
začepe aluminijskom folijom i autoklaviraju.


Površinska sterilizacija vrši se u laminarnom, specijalnom
radnom prostoru sa sterilnim strujanjem zraka.
U staklenu flašicu se pipetom doda kap detrdženta i 10
% otopine varikine. U ovoj fazi rada pipete ne moraju
biti sterilne, a biljni materijal može se rukom ubaciti u
flašicu sa sredstvom za površinsku sterilizaciju.


Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354


Lisni materijal potopljen u, ovako pripremljenu
otopinu za površinsku sterilizaciju, treba intenzivno
promućkati 2–10 minuta, dok je standardno vrijeme za
sterilizaciju pupoljaka u trajanju od 20–30 minuta. Po
isteku vremena namijenjenog površinskoj sterilizaciji
otopina varikine se odlije, zatim se u flašicu nalijeva
autoklavirana (sterilizirana) voda. Uobičajeno je da se
sterilizirana voda promijeni bar 3 puta u trajanju od 5
minuta u svakoj posudi.


Za uspješnost površinske sterilizacije izuzetno je
važno da biljni materijal bude svjež.


3.2.2 Autoklaviranje instrumenata – Sterilization
Instrumenti (skalpeli, pincete), filter papir i sta- Autoklaviranje je proces koji služi za sterilizaciju
kleno laboratorijsko posuđe sterilizirano je u suhom destilirane vode i magenti s podlogama te zaraženih
sterilizatoru, u trajanju od 1–3 sata na temperaturi od medija s izbojcima, a vrši se u autoklavu na temperatu180
°C. ri od 120 °C u trajanju od 30 min.


3.3. Priprema hranjive podloge Preparison of nutritious base
Tablica 2. Sastav osnovne podloge za multiplikaciju U ovom radu je, kao osnovna podloga, korištena
Table 2 Composition of primary base for multiplication modificirana podloga “Woody Plant” (WPM), osim


Sastav


Makroelementi


NH4NO3
KNO3
CaCl2 x 2H20
MgSO4 x 7H2O
KH2PO4


Mikroelementi


MnSO4x H2O
ZnSO4 x H2O
H3BO3
Na2MoO4 x H2O
CuSO4x 5 H2O


Željezo


Na2EDTA
FeSO4x 7H2O


Vitamini


Thiamin HCl


Nikotinska kiselina


Pyridoxin-HCl
Glicin


Šećeri


Myo-inositol
Saharoza


pH


Agar


Koncentracija (mg/l) makroelemenata koji su pripremljeni prema recepturi
za Murashige i Skoog (MS) podlogu, što se vidi u ta1.650,00
blici 2. (Murashige i Skoog 1962.)


1.900,00 U podlozi za multiplikaciju korištene su dvije
440,00 različite kombinacije biljnih regulatora rasta: 0,5 mg/l
370,00 BA (M1) i 0,25 mg/l BA (M2); dok je podloga za za170,00
korjenjivanje zahtijevala pasažu biljaka na podlozi sa


0,1 mg/l IBA (Z) u trajanju od sedam dana, nakon čega


22,30 su presađene na medij bez hormona (BH) (Tablica 3).
8,60
6,20 Tablica 3. Koncentracije biljnih regulatora rasta u korište


0,25
0,25 Table 3


37,30 Podloga
27,80 Ml
M2


1,00 Z
0,50 BH
0,50
2,00


100,00


30.000,00
5,7-6,2
9000


nim podlogama.
Concentration of herbal plant growth regulators


in used bases
Sastav
Osnovna podloga
Osnovna podloga
Osnovna podloga
Osnovna podloga


BAmg/l IBA mg/l
0,50 /
0,25 /
/ 0,10
/ /


3.4. Rad u laminaru – Laminar work
Laminar je komora kroz koju u horizontalnom mogli dospjeti do podloge ili uzorka u procesu inokusmjeru
protiče sterilni zrak. Fini filteri ovoga aparata lacije. Laminar posjeduje UV lampe, koje se uključuju
zadržavaju sve nepoželjne mikroorganizme, koji bi najmanje jedan sat prije početka rada.




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 30     <-- 30 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.)
Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
Prije unošenja uzoraka, podlogâ i instrumenata neopRad
u laminaru obuhvaća sljedeće faze mikroprohodnih
za rad u laminar, potrebno je isključiti UV lampe, pagacije:
osigurati cirkulaciju sterilnog zraka barem 15 minuta Obrada


brada biljno
biljnobiljnogg materijala,


prije početka rada, te ruke i radni pult laminara prebrisati
96 % etilnim alkoholom (Međedović 2003). Multiplikacija izbojcima,


Unutar laminara nalazi se špiritna lampa i čaša s Izduživanje izbojaka i
alkoholom, u kojemu se drže sterilni skalpeli i pincete, Ožiljavanje
zbog kontinuiranog steriliziranja na otvorenom plamenu.


3.4.1. Obrada biljnog materijala Processing of the plant material
Materijal koji je površinski sterilan i ispran sterilpelom
odsijeca ranjeno mjesto gdje je pupoljak bio odnom
vodom, treba sterilnom pincetom prenijeti na stesječen
prije površinske sterilizacije. Uz to, pupoljcima,
rilnu podlogu na dalju obradu, tj. isijecanje skalpelom. bez obzira da li su otvoreni ili ne, treba ukloniti vanjske
listiće.
U ovoj fazi pupoljci se skraćuju na način da se skal


– Multiplication by sprouts
3.4.2. Multiplikacija izbojcima
se skraćuje s porastom temperature. Ukoliko želimo


Za svaku biljnu vrstu potrebno je empirijski, tj. is


produžiti vrijeme trajanja pasaža, kulture možemo pre


traživanjem, definirati formulu i balans biljnih hormo


nijeti u hladnu sobu ili frižider.


na koji će suzbiti pojavu i rast nediferenciranog kalusa
Osnovni parametar multiplikacije je tzv. “indeks


i favorizirati samo rast vršnog i aksilarnih meristema.
multiplikacije”, koji pokazuje prosječan broj novih pu


Dominantnu ulogu u regulaciji imaju citokinini (BAP;
poljaka koji se tijkom subkulture razvijaju iz jednog


6-benzil aminopurin), kinetin (6-furfuril aminopurin),
(pojedinačnog) pupoljka i koji se mogu koristiti kao


2iP (izopentil adenin) i zeatin. Citokinini omogućavaju
eksplantati u sljedećem pasažu. Najčešće, medijumi za


da se aksilarni pupoljci oslobode apikalne dominacije,
multiplikaciju uz citokinin sadrže i jedan auksin, obič


odnosno da se slobodno izdužuju. Jednostavnije rečeno
IBA, i to u koncentraciji od 0,1–0,2 mg/l, u kojoj


no, u fazi multiplikacije koriste se hranjive podloge s
IBA potpomaže bolje izduživanje eksplantata.


citokininima koji stimuliraju izduživanje svih pupoljaka
na eksplantatu. Koncentracija BAP od 0,5 do 1,0 mg/l je optimalna


Prosječna dužina trajanja pasaža (subkulture) u fazi za multiplikaciju velikog broja različitih dikotiledonih
multiplikacije izbojaka iznosi 4–5 tjedanaa. Ovakve biljaka, jer podloga za multiplikaciju izbojaka treba
kulture rastu dok ne utroše sav medijum (podlogu) u omogućavati nesmetani rast i umnožavanje eksplantakoji
su posađene. Kod mnogih dikotiledonih vrsta nata,
a da istovremeno ne izaziva obilnije kalusiranje.
kon 4–5 tjedana trajanja pasaža rast prestaje i kulture se Pouzdano se može reći da je hormonski par
počinju sušiti, iako u flašicama ima još uvijek neisko-BAP/IBA najčešće korišteni par hormona u mikroprorištenog
medijuma. Dužina trajanja pasaža izravno ovisi pagaciji, posebno kod dikotiledonih vrsta.
od temperature komore za gajenje kultura, i to tako što


3.4.3. Izduživanje izbojaka – Sprouts elongation
Kod nekih biljnih vrsta preporučuje se da se između biti višestruka, ali uglavnom služi da omogući dovoljfaza
multiplikacije i ožiljavanja ubaci jedna međufaza, no dugačke izbojke za fazu ožiljavanja.
tzv. faza izduživanja (elongacije). Svrha ove faze može


3.4.4. Ožiljavanje Rooting
Za ožiljavanje se koriste izduženi izbojci, obično ne na podlogu za ožiljavanje.
manji od 10 mm, koji se isijecaju s busenova i prenose


3.5. Aklimatizacija – Aclimatization
Aklimatizacija je završna faza mikropropagacije. U Kod skoro svih dikotiledonih biljaka, listovi forminjoj
se ožiljene biljke vade iz posuda, u kojima su bile rani tijekom rasta u in vitro uvjetima ne mogu funkciokultivirane
i rasađuju u zemljišni supstrat. Prije same nirati u uvjetima uobičajene, niske relativne vlažnosti
sadnje korijenov sustav se vodom ispire od zaostalih zraka, kakva normalno vlada u vanjskoj sredini.
čestica agara.
Aklimatizacija se upravo i vrši s ciljem da se in vitro
sadnica prilagodi toj niskoj vlažnosti zraka.




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 31     <-- 31 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.)
Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
Aklimatizacija se obično obavlja u plastenicima i
staklenicima, a sadnica zasađena u kontejnerima štiti
se plastičnom folijom 2 do 4 tjedna, odnosno dok ne
krene formiranje novih listova.


Što se tiče zemljišnog supstrata u koji se prenose
biljke, ožiljene in vitro radi daljeg uzgoja, potrebno je


omogućiti takvu mješavinu komponenti koja će dati
supstratu sitnu mrvičastu strukturu i dobru aeraciju. U
tu svrhu može se koristiti mješavina treseta i pijeska, a
po potrebi i perlita.


3.6. Metode rada – Methods
Ubičajeni rad odvija se kroz sljedeće faze mikropropagacije:


1.
Prikupljanje materijala za mikropropagaciju,
2.
Površinska sterilizacija,
3.
Obrada biljnog materijala,
4.
Uspostavljanje inicijalne kulture,
5.
Multiplikacija izbojaka,
6.
Izduživanje izbojaka,
7.
Ožiljavanje izbojaka i
8.
Aklimatizacija.
Biljni materijal korišten u ovom eksperimentu potiče
iz laboratorije Firenze Scienze e Tecnologie Ambientali
Forestali i on je već bio uveden u kulturu, tako
da su se u ovom radu izvodili samo postupci pod rednim
brojevima 5–8, tj. multiplikacija izbojaka, izduži


vanje izbojaka, ožiljavanje izbojaka i njihova aklimatizacija.


Naime, biljke su u sterilnim (aseptičnim) uvjetima
vađene iz Ewrlenmajer posuda i pomoću skalpela odstranjeni
su oštećeni listovi i eventualni kalus. Potom
je stabalce segmentirano na pojedinačne eksplantate s
barem jednim nodijem, veličine 1–2 cm. Ovako secirani
eksplantati su prebacivani na svježu podlogu za
multiplikaciju.


Prenos eksplantata na svježe podloge vršio se svakih
28–35 dana, što je, zapravo, i predstavljalo vrijeme supkultivacije
(pasažiranja). Naime, usporavanje i zaustavljanje
rasta eksplantata nastupa zbog osiromašenja hranjiva,
sušenja agara, produkcije otrovnih bioproizvoda i
smanjenja količine oksigena u unutrašnjosti posude,
tako da je potrebno samo zdrava tkiva subkultivirati.


Na podlogama za multiplikaciju nastojalo se vršiti
umnožavanje izbojaka, tj. indukcija diferencijacije no


vih izbojaka iz bočnih pupoljaka. Otprilike, nakon
mjesec dana lako su se mogli uočiti i odstraniti novi
bočni ogranci od matičnog stabalceta.


U Erlenmajer posude, s podlogama za multiplikaciju
je inokulirano u prosjeku po deset eksplantata.


Dio eksplantata je “žrtvovan” u različitim vremenskim
intervalima kako bi se izmjerile i dobile srednje
vrijednosti svježe i suhe mase. Masa suhih uzoraka
određivana je tako što su se uzorci prvo sušili četiri
sata u termostatu na temperaturi od 105 °C. Masa svježih
eksplantata, kao i masa suhih eksplantata određivana
je na analitičkoj vazi.


Po 3–5 izbojaka koji su postigli visinu od 3–4 cm
prebacivani su u Erlenmajer posude s podlogom za zakorjenjivanje,
a nakon sedam dana u Erlenmajer posude
s podlogom bez hormona, što je na kraju rezultiralo
pojavom korjenčića i kompletiranjem biljaka.


Na ovaj način, dobivene biljčice sa razvijenim korijenovim
sustavom su potom presađivane u zemljišni
supstrat (sterilna smjesa zemlje i pijeska u omjeru 3:1)
i prilagođivani na ex vivo uvjete života.


Kulture su održavane u klima komori za rast biljaka,
gdje su kontrolirani uvjeti temperature (25–28 °C),
relativne vlažnosti zraka (60–80 %), intenziteta svjetlosti
(3.000 lx) i fotoperiodizma (16 sati svjetlosti i 8
sati mraka).


Zasađene biljčice u teglama bile su prvih sedam
dana pokrivene staklenim čašama i redovno zaljevane
sterilnom vodom. Tijekom ovih sedam dana čaše su
“uklanjane”, u početku par minuta, a kasnije sve duže,
dok se osmi dan čaše nisu potpuno uklonile i biljke počele
zaljevati nesterilnom vodom.


4. REZULTATI RADA – The results of investigation
4.1. Faza multiplikacije – Multiplication phases
Na osnovne podloge za multiplikaciju, modificirani
Woody Plant Medium (WPM) uz dodatak 0,25 mg/l
BA (M1) ili 0,5 mg/l BA (M2) presađeni su sterilni izbojci
i njihovi dijelovi, različitih veličina. Izbojci su
presađivani (pasažirani) suksesivno svakih 4–5 tjedana
tijekom devet mjeseci izvođenja eksperimenta (od XI
2006. do VI 2007. godine).


U ovom periodu zamijećeno je da se izbojci drukčije
ponašaju na navedenim podlogama. Naime, zbog pro


cjene potencijalne multiplikativnosti i stope multiplikacije
date vrste potencijalni eksplantati razdvajani su s
matičnog eksplantata i presađivani na novu podlogu.


Tijekom prvih pet, od osam pasaža, bila je prisutna
umjerena stopa multiplikacije na obje podloge, tako da
je na podlozi M1 iznosila 5,36 po eksplantatu, a na
podlozi M2 5,86 po eksplantatu. Međutim, u sljedećim
pasažama došlo je do značajne promjene, te se broj novih
izbojaka po eksplantatu na podlozi M1 smanjio na




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 32     <-- 32 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
Slika 3. Kulture bijele topole nakon četiri sedmice kultiviranja


Picture 3 Cultures of white poplar after four weeks of cultivitation
Slika 2 Kultura bijele topole u klima komori
Picture 2 Culture of white poplar in climate chamber


prosječnih 1,8; dok se na podlozi M2 povećao na 13,45 statistički podaci (tablica 4) za stopu rasta biljnog mapo
eksplantatu. Izbojci su bili vitalni, normalnog obliterijala
u uvjetima in vitro. Iz datih podataka može se
ka i boje za bijelu topolu, ali različite visine. vidjeti da izbojci uzgajani na podlozi M1 imali su sred


Može se reći da je multiplikacija bila 100 % uspješ-nje vrijednosti prirasta svježe mase od 0,04022 g i suhe


M
na, i da su novodobiveni izbojci, ovisno o visini, koriš-mase od 0,00888 g, tj. u sljedećem kontrolnom mjereteni
za: daljnju multiplikaciju, određivanje svježe i suhe nju srednju vrijednost svježe mase od 0,03588 g i suhe
mase eksplantata ili zakorjenjivanje. mase od 0,00630 g. S druge strane, eksplantati na pod


lozi M2 su imali srednje vrijednosti svježe mase od


Nakon “žrtvovanja” eksplantata i prikupljanja po


0,03851 g, tj. 0,00743 g i suhe mase od 0,02988 g i


dataka svježe i suhe mase izračunali su se i osnovni


0,01397 g.


Tablica 4. Pregled statističkih vrijednosti svježe i suhe mase eksplantata.
Table 4 Review of stastistic values of fresh and dry explantat mass


Mjerenje Statistički parametri M1 podloga
Svježa masa (g) Suha masa (g)
M2 podloga
Svježa masa (g) Suha masa (g)
Min. 0,00632 0,00063 0,00378 0,00186
Max. 0,10864 0,06729 0,11671 0,01833
1. Stand.dev. 0,02812 0,01417 0,02875 0,00437
Aritm. sred. 0,04022 0,00888 0,03851 0,00743
Koef. var. 0,69924 1,59533 0,74651 0,58763
Min. 0,00738 0,00219 0,00660 0,00146
Max. 0,09248 0,01342 0,09322 0,08566
2. Stand.dev. 0,02058 0,00294 0,02066 0,02129
Aritm. sred. 0,03588 0,00630 0,02988 0,01397
Koef. var. 0,57368 0,16612 0,69142 1,52470


4.2. Faza zakorjenjivanja – Rooting phases
Za zakorjenjivanje su se koristile
podloge Z (sa 0,1 mg/l IBA) i BH
(bez hormona). Naime, u cilju inicijacije
formiranja korijenčića su izbojci,
veličine 3–4 cm, presađivani
na podlogu Z, na kojoj su kultivirani
idućih sedam dana. Nakon toga
su, ovako tertirani izbojci, ponovo
prebacivani na svježu podlogu i to
podlogu bez hormona, na kojoj je
dolazilo do razvoja korijenovog sustava.
Zakorjenjivanje je bilo stopostotno
za obje linije multipliciranih
izbojaka.


Slika 4. Kompletne individue u magenti Slika 5. Kompletna individua


Picture 4 Complete individuals in magenta Picture 5 Complete individua




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 33     <-- 33 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
4.3. Faza aklimatizacije
U ovoj fazi ožiljene su biljke prenešene iz sterilnih
posuda u kojima su bile kultivirane i zasađene u zemljišni
supstrat (zemljište i pijesak u omjeru 3:1) izvan
klima komore.


– Aclimatization phases
Naime, korijenov sustav je bio očišćen od čestica
podloge s agarom pomoću mlaza sterilne destilirane
vode, pa su biljke presađivane u zemljišni supstrat, koji
je prethodno steriliziran sa fungicidom. Ove mlade


Slika 6. Faza aklimatizacije bijele topole (neposredno pri zasađivanju; nakon sedam dana; nakon tri mjeseca).
Picture 6 Aclimatization phase of the white poplar


biljke nisu imale dovoljno razvijenu kutikulu, funkcionalan
stomatalni aparat, dobru vaskularnu vezu između
korijena i izbojka, slabo razvijene korijenske dlačice,
itd., te je bilo potrebno postepeno ih navikavati na
uvjete ex vivo. To je postignuto privremenom zaštitom
mladih biljaka sa sterilnom staklenom čašom, čije otklanjanje
je strogo kontrolirano i vremenski se produ


užava
svaki dan kako bi došlo do razmjene plinova.


S
druge strane, prvih sedam dana ove su biljke zaljevan
sa sterilnom destiliranom vodom, a nakon toga običnom
vodom iz vodovodnog sustava.
Iako je ova faza često kritična, sve presađene individue
aklimatizirale su se na uvjete relativne niske
vlažnosti zraka, koji vladaju u vanjskim uvjetima, tj.
uvjetima ex vitro.


Slika 7. Aklimatizirane bljke bijele topole na uvjete ex vitro.
Picture 7 Aclimated plants of white poplar on ex vitro conditions


5. RASPRAVA – Discusion
U in vitro uvjetima, a u cilju multiplikacije izbojaka,
vrsta Populus alba je vrlo dobro reagirala. Upotrijebljena
tehnika multiplikacije u ovom radu bila je
učinkovita i brza, te se može široko primjenjivati u mikropropagaciji
brzorastuće bijele topole.


Stopa multiplikacije na podlozi M1 je iznosila, u
prosjeku 5,36, odnosno u iduće tri pasaže samo 1,8
izbojaka po eksplantatu, dok je na podlozi M2 bila
dosta drukčija situacija. Naime, stopa multiplikacije je
na podlozi M2 u prvih pet pasaža iznosila 5,86, a po


tom se povećala na 13,45. Iz dobivenih rezultata moglo
se uočiti da je na ponašanje eksplantata bijele topole, u
uvjetima in vitro, najviše utjecaja imao balans egzogeno
dodatih hormona u podlogu. Dugoročno gledano, u
našem eksperimentu, je eksplantatima više odgovarala
veća koncentracija BA hormona (0,5 mg/l) u podlozi,
jer nije dolazilo ni do kakve vidljive promjene u izgledu
izbojaka i stvaranja kalusa, već samo do povećanja
brojnosti novih izbojaka, a nakon prosječnih četiri tjedna
kultiviranja.




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 34     <-- 34 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.)
Međutim, D o u g l a s et al. (preuzeto iz J e l a s ka
1994) i Međedović et al. (2006) navode da zeatin
značajno utječe na regenearciju eksplantata topole, što
je Beganović (2001) u svom diplomskom radu, potvrdila
ali na materijalu vrste Populus tremula L.
Naime, Beganović (2001) je u svom radu izvršila
usporedbu ponašanja eksplantata jasike na različitim
podlogama i izvijestila da je u njenim pokusima najbolja
podloga za multiplikaciju bila WPMZ s dodatkom
1,0 mg/l zeatina, i to čak 50 % u odnosu na MS podlogu
s istom količinom ovog hormona rezultatima, što se
podudara s podacima koje su naveli Gözükirmizi et
al. (1998). U istom radu, Beganović (2001) navodi
da je maksimalan broj izbojaka po eksplantatu iznosio
17, dok je u našem eksperimentu iznosio 16.


Dobiveni rezultati u ovom radu o stopi multiplikacije
donekle se poklapaju i s dobivenim podacima o
stopi rasta biljnog materijala. Naime, mjerenjem svježe
i suhe mase eksplantata, na obje podloge, moglo se uočiti
da su izbojci imali ravnomjeran prirast. Ali, na podlozi
M1, iako je došlo do smanjenja broja novih izbojaka
po eksplantatu, ipak je došlo do povećanja srednjih
vrijednosti masa izbojaka. S druge strane, na podlozi
M2 došlo je do smanjenja povećanja mase izbojaka, što
se i očekivalo, s obzirom na to da je došlo do znatnog
povećanja broja izbojaka po eksplantatu. Očit uzrok
uočenoj pojavi je odnos novonastalih individua i


nja, .


količine pristupačnih hranjivih materija, tj
tjtj. prave borbe
za prostor i opstanak individua.


Chun et al. (1986) navode da na in vitro razmnožavanje
Populus alba x Populus grandidentata, tj.
masu izbojaka i njihov broj po eksplantatu utiče konzistencija
hranjive podloge. Naime, oni su imali znatno
bolje rezultate u tečnim nego na čvrstim podlogama, i
to skoro u dvostruko većim vrijednostima mjerenih
parametara. Isti autori navode da su zamijetili da se


6. ZAKLJUČCI
Na temelju dobivenih rezultata multiplikacije, zakorjenjivanja
i aklimatizacije, zaključili smo sljedeće:
> Uspješno je proveden postupak multiplikacije bije


le topole šPopulus alba L.) u in vitro uvjetima, i to


na modificiranoj osnovoj podlozi WPM uz dodatak


0,25 mg/l šM1) i 0,5 mg/l šM2) BA.
> Stopa multiplikacije je u prvima pasažama bila neš


to manja i iznosila je u prosjeku 5,36, odnosno u


iduće tri pasaže samo 1,8 izbojaka po eksplantatu


(podloga M1), dok je na podlozi M2 iznosila 5,86, a


potom se povećala na 13,45.
> Mjerenjem svježe i suhe mase eksplantata (stope


rasta biljnog materijala) uočilo se da je na podlozi


M1 došlo do smanjenja broja novih izbojaka po


eksplantatu, ali i do povećanja srednjih vrijednosti


masa izbojaka, dok je na podlozi M2 došlo do


Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354


povećavanjem broja eksplantata po posudi usporava
rast eksplantata, smanjuje njihova masa, kao i da nastaje
manji broj novih izbojaka. Također, Smith (2000)
navodi da svježa masa općenito korelira sa suhom masom,
s vrijednostima iznad 0,5 g.


U našem radu ostvareno je 100 % zakorijenjivanje
jedinki na modificiranoj podlozi WPM uz dodatak 0,1
mg/l IBA, i to u trajanju od sedam dana. Nakon tog razdoblja
jedinke su se prebacivale na modificiranu osnovnu
podlogu bez hormona, na kojoj je dolazilo do dobrog
razvoja korijenovog sustava, što je poslije potpomoglo i
odličnu aklimatizaciju biljčica. Gözük i rm iz i et al.
(1998) u svom radu navode da je za većinu istraživanih
klonova topola WPM sa 0,5 mg/l IBA omogućavala stopostotno
zakorjenjivanje biljaka; dok su WPM sa 2 mg/l
IBA i 0,1 mg/l NAA bile djelimično uspješne. Began
o v ić (2001) je u svojim pokusima najbolje rezultate
rizogeneze ostvarila na WPM uz dodatak 0,5 mg/l IBA.


Aklimatizacija zakorijenjenih biljaka bila je vrlo
uspješna, jer su svi zasađeni primjerci bijele topole u
smjesu zemlje i pijeska (omjera 3:1) preživjeli i nastavili
s normalnim rastom. Naime, u laboratorij su biljke
prenešene u zemljišni supstrat uz kontroliranje razmjene
plinova i zaljevanje sterilnom vodom idućih
sedam dana. Ovako tretirane biljke uspješno su aktivirale
svoje sustave za fotosintezu i transpiraciju, poboljšale
vaskularne veze između nadzemnog izdanka i
korijena, povećale zaštitini sloj kutikule te izgradile relativno
velik broj korijenskih dlačica, što im je omogućilo
brzu prilagodbu na ex vitro uvjete.


Tijekom eksperimenta, na biljnom materijalu nisu
primijećene fenotipske promjene, kako u uvjetima in
vitro tako ni u uvjetima in vivo.


-Conclusions
smanjenja povećanja mase izbojaka i znatnog povećanja
broja izbojaka po eksplantatu.


> Ostvareno je 100 % zakorijenjivanje jedinki na modificiranoj
podlozi WPM uz dodatak 0,1 mg/l IBA.
Nakon sedam dana jedinke su s ove podloge prebacivane
na modificiranu osnovnu podlogu bez hormona
na kojoj se razvijao korijenov sustav u iduća
tri tjedna.


> Aklimatizacija zakorijenjenih biljaka bila je uspješna,
jer su svi zasađeni primjerci bijele topole u
smjesu zemlje i pijeska (omjera 3:1) preživjeli i nastavili
s normalnim rastom.


> Tijekom eksperimenta, na biljnom materijalu nisu
primijećene fenotipske promjene, kako u uvjetima
in vitro tako ni u uvjetima in vivo.




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 35     <-- 35 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
7. LITERATURA – References
Beganović, S. 2001. Klonska propagacija topole Međedović, S., Dž. Ferhatović, 2003. Klonska
(Populus tremula L.) u kulturi in vitro. Diplom- proizvodnja sadnica drveća i grmlja. Bemust,
ski rad. Univerzitet u Sarajevu, Sarajevo. Sarajevo.


Chun, Y. W., R. B. Hall, L. C. Stephens, 1986. Smith, R. H., 2000. Plant tissue culture. Techniques
Influences of medium consistency and shoot and experiments. Second edition. Academic
density on in vitro shoot proliferation of Populus Press.
alba × P. grandidentata. Plant cell, tissue and Vin t e r h a l t e r, D., B. Vi n te r ha lt er, 1996. Kultuorgan
culture, 5(3): 179–185. ra in vitro i mikropropagacija biljaka, Axial,


Gözükirmizi, N., K. Bajrović, Z. Ipecki, M. Beograd.
Boydak, T. Akalp, K. Tunctaner, H. ™eograd.,,/gatunki/Populus_alba.htm
Balkan, H., Tanriyar, M. Calikoglu, T.


www.fichas.infojardin.com/arboles/populus-alba-


Ogras, Ö. Özden, M. Tulukcu, T. Tank,
1998. Genotype differencies in direct plant rege alamo-blanka-chopo-blanca.htm
neration from stem explants of Populus tremula www.terra.hu/haznar/htm/Populus.alba.html
in Turkey. J. For. Res. 3: 123–126.
Je la s k a , S., 1994. Kultura biljnih stanica i tkiva,
Školska knjiga, Zagreb.


SUMMARY: The plant material used in this experiment derives from the
laboratory Firenza Scienza e Tecnologia Ambientali Forestali. It had already
been introduced into the culture so that in this paper we only conducted the
procedures of shoot multiplication, shoot lengthening, shoot restoration and
their acclimatization. Namely, the plants were taken from Erlenmeyer flasks
in sterile (aseptic) conditions. The damaged leaves and the callus were
removed with a scalpel. The tree was then segmented into individual explants
with at least one node of 1–2 cm. The dissected explants were transferred to
the fresh multiplication medium. The culture was multiplied in the basic medium:
modified Woody Plant Medium (WPM; MS /Murashige and Skoog/ macroelements,
WPM – microelements and vitamins) with the addition of


0.25 or 0.5 mg/l BA (6-benzyladenine).
The explants were transferred to fresh mediums every 28–35 days, which
in fact represented the subcultivation period (passaging) during the nine-
month duration of the experiment (from November 2006 to June 2007). The
growth of the explants was slowed or halted due to impoverished nutrients,
the drying of the agar, the production of poisonous bioproducts and lower
quantity of oxygen in the flask. Therefore, only the healthy tissue was subcultivated.
The shoots were multiplied in multiplication mediums; in other
words, new shoots were differentiated by induction from lateral buds.
Approximately one month later new lateral branches could easily be identified
and removed from the parent tree. At this period it was noticed that the
shoots behaved differently in the mentioned mediums. In order to assess
potential multiplication and the multiplication rate of a given species, the
potential explants were separated from the parent explant and transferred to
the new medium.
The shoot multiplication rate in these mediums varied and amounted to


5.36 per explant for M1 medium and to 5.86 for M2 medium during the first
five passages. However, in the subsequent passages the lines were clearly
separated and the number of new shoots per explant on M1 medium dropped
to the average 1.8; whereas it rose to 13.45 per explant on M2 medium.
The growth rate of the plant material of white poplar under in vitro conditions
was proportionate to the multiplication rate in both types of multiplica




ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 36     <-- 36 -->        PDF

B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354
tion mediums. However, plant growth rate in M1 medium was more distinct
compared to M2 medium, where this relationship changed very quickly and
clearly in the three following passages. Thus, the M2 medium proved superior
for long-lasting use of these explants under in vitro cultures.


A part of the explants was “sacrificed” at different time intervals in order
to obtain and measure mean fresh and dry mass values. After “sacrificing”
the explants and collecting fresh and dry mass data, some basic statistical
data were calculated (Table 4) for the growth rate of the plant material under
in vitro conditions. According to the data, the shoots cultivated in the M1
medium had mean fresh mass values of 0.04022 g and dry mass of 0.00888 g.
The subsequent control measurements showed the mean fresh mass value of
0.03588 g and dry mass value of 0.00630 g. On the other hand, the explants
cultivated in the M2 medium showed fresh mass values of 0.03851 g and
0.00743 g and dry mass values of 0.02988 g and 0.01397 g.


Isolated shoots sized about 3-4 cm showed 100 % rooting under in vitro
conditions after being planted into the rooting medium (Z) with the addition
of 0.1 mg/l IBA (Indol Butric Acid) for seven days and their transplanting into
the basic hormone-free medium (BH) in the following tree weeks. In the
acclimatization stage, the rooted plants were transferred from the sterile containers
in which they were cultivated into the soil substrate (soil and sand at


3:1 ratio) outside the chamber climate.
The root system was cleaned from the medium particles with agar using a
spray of sterile distilled water. The plants were transplanted into the soil substrate
previously sterilized with fungicide. These young plants did not have a
sufficiently developed cuticula, a functional stomatal apparatus, a good vascular
connection between the root and the shoot, well developed root hairs,
etc., so it was necessary to acclimatize them gradually to the ex vivo conditions.
This was achieved with temporary protection of the young plants with
sterile glass containers. The removal of the containers was strictly controlled
and the period of removal was lengthened every day in order to enable gas
exchange. On the other hand, for the first seven days the plants were watered
with sterile distilled water and after that with tap water.
Although this is usually a critical stage, all the transplanted individuals
managed to acclimatize to relatively low air humidity prevailing in external
conditions (ex vitro conditions). No phenotypal changes were observed on the


o pplant material either in in vitro or i
iin
nn vivo conditions during the experiment.