DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 25 <-- 25 --> PDF |
STRUČNI ČLANCI PROFESSIONAL PAPERS Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 UDK 630* 165 MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) MICROPROPAGATION OF WHITE POPLAR (Populus alba L.) Bojana PINTARIĆ* SAŽETAK: Kultura je multiplicirana iz nodalnih segmenata i vrhova sterilnih izbojaka bijele topole (Populus alba L.) na osnovnoj podlozi: modificiranoj podlozi Woody Plant Medium (WPM; MS /Murashige i Skoog/ – makroelementi, WPM – mikroelementi i vitamini) uz dodatak 0,25 ili 0,5 mg/l BA (6-benziladenin). Stopa multiplikacije izbojaka na ovim podlogama bila je različita i iznosila je 5,36 po eksplantatu za M1 podlogu, tj. 5,86 za M2 podlogu u toku prvih pet pasaža. Međutim, u idućim pasažama došlo je do jasnog odvajanja linija, te se broj novih izbojaka po eksplantatu na podlozi M1 smanjio na prosječnih 1,8; dok se na podlozi M2 povećao na 13,45 po eksplantatu. Stopa rasta biljnog materijala bijele topole, u uvjetima in vitro, bila je proporcionalna stopi multiplikacije na oba tipa podloga za multiplikaciju. Međutim, na podlozi M1 je u prvih pet pasaža stopa biljnog rasta bila izraženija u odnosu na podlogu M2, gdje se taj odnos vrlo brzo i jasno u iduće tri pasaže promijenio, tako da se za dugotrajniju uporabu ovih eksplantata u uvjetima kulture in vitro podloga M2 pokazala kao bolja. Izolirani izbojci, veličine oko 3–4 cm, u uvjetima su se in vitro 100 % zakorjenili pri tretmanu zasađivanja na podlogu za zakorjenjivanje (Z) uz dodatak 0,1 mg/l IBA (indolbuterna kiselina) u trajanju od sedam dana i njihovog presađivanja na osnovnu podlogu bez hormona (BH) iduća tri tjedna. Ovako zakorijenjene individue uspješno su preživjele prijenos u sterilni zemljišni supstrat (zemlja i pijesak u omjeru3:1) i aklimatizaciju u uvjetima in vivo. Ključne riječi: Populus alba L. i mikropropagacija 1 11. UVOD – Introduction 1.2. Kultura in vitro i tipov tipovtipovi ii kultura – Culture in vitro and the tipes of cultures Kultura in vitro je postupak koji podrazumijeva rast vrste. Bez sumnje, to je proces kloniranja, jer sve proizvrlo sitnih organa, komadića tkiva ili izoliranih stanica vedene biljke predstavljaju matične kopije razmnožeu aseptičkim (sterilnim) uvjetima. Sam naziv kultura in nog majčinskog uzorka (Međedović 2003). vitro označava uzgoj kultura u staklu ili prozirnim Postupci kulture in vitro mogu biti primijenjeni u posudama. Ovaj način razmnožavanja biljaka često se raznim biotehnočoškim i genetičko-inžinjerskim zanaziva mikrorazmnožavanje, jer su biljni organi ili cijehvatima u smislu očuvanja i zaštite genofonda neke le biljke, u odnosu na generativnu proizvodnju, u miniugrožene vrste, razmnožavanja genetički superiornijih jaturnim dimenzijama. Sam postupak osigurava vrlo stabala, žalosnih formi drveća i grmlja, oblika otpornih brz proces dobivanja velikog broja serija biljaka, koje na kemijski stres, zagađenost atmosfere, otpornost pre su istovjetne po razvoju, rastu i genetičkom potencijalu ma određenim pesticidima i herbicidima, itd. Kultura in vitro predstavlja najmoćnije oruđe moderne genetike i molekularne biologije u cilju israživanja rasta i razvoja biljaka, te njihove biokemije i fiziologije se * Dipl. ing. hort. Bojana Pintarić kundarnih metabolita (Međedović 2003). Ante Babića 3, Sarajevo |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 26 <-- 26 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 Postoje različiti pristupi u klasifikaciji tehnika kulture biljaka u uvjetima in vitro. Tehnike se mogu dijeliti ili po tipu eksplantata koji se uvodi u kulturu (ćelije, organi, tkiva) ili po namjeni (haploidi, somatska embriogeneza, somaklonarno variranje, itd.), što je predstavljeno na shemi br. 1. (Vi n t e r h a l t er et Vi nt erh a l t er 1996). Tri kronološki najstarije in vitro tehnike kod biljaka su: kultura tkiva (stanica), kultura embriona i kultura korijenova. Iako su odigrale važnu ulogu u općem razvoju tehnike kulture in vitro, na njima se danas vrši razmjerno malo istraživanja. Shema 1. Tipovi eksplantata koji se koriste za pokretanje in vitro kultura (Vinterhalter et Vinterhalter 1996). Sheme 1 The types of explantants which are used for in vitro cultures initiation 1.2.1. Tipovi kulture in vitro Višestanični biljni organizam izgrađuju različiti tipovi stanica i diferenciranih tkiva. S tim u vezi postoje i različiti tipovi kultura koje se imenuju prema organu, odnosno tipu tkiva početnog eksplantata. Tako se prema vrsti eksplantata razlikuju: a) Kultura cijelih (intaktnih) biljaka, b) Kultura embrija, c) Kultura korijena, d) Kultura antera, e) Kultura meristema, f) Kultura apikalnog i aksilarnog pupa i g) Kultura pojedinačnih nodija. Ako se krene od definicije kulture in vitro, kao zajedničkoga nazivnika manipulacije biljnim uzorkom u sterilnim uvjetima, važnost definicije odnosi se samo na, u užem smislu riječi, kulturu neorganiziranih naku – Tipes of culture in vitro pina stanica, tj. kalusa. Međutim, uporabom eksplantata vršnog meristema izdanka stabla ili korijena procesi razvoja i diferencijacije bit će nastavljeni u istom smijeru (formiranjem izbojka ili korijena), što predstavlja organizirani rast. S druge strane, procesi proliferacije mogu biti usmjereni na kalusiranje, gdje se stanice umnožavaju bez inputa diferencijacije (neorganiziran rast). Organiziran rast u kulturi in vitro nastaje proliferacijom početnog eksplantata u smjerovima koji su genetički determinirani u početnom biljnom uzorku. Uz vršne meristeme, organizirani rast nastavljaju i aksilarni meristemi, lisni zameci, mladi cvijetni pupovi i sl. Neorganiziran rast javlja se kod eksplantata koji ne sadrže niti jednu poznatu strukturu iz biljnog organizma ili su s ograničenim brojem različito diferenciranih stanica. Ovom tipu kulture pripadaju (Međedović 2003): |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 27 <-- 27 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 a) Tkivna kultura (kalus), c) Kultura pojedinačnih stanica (kultura polena) i b) Kultura stanica u suspenziji, d) Kultura protoplasta. 1.3. Mikropropagacija drvenastih vrsta – Micropropagation of woody species Mikropropagacija je postupak u kojemu se za kultiviranje koriste isključivo izbojci stabla osovinskog porijekla, tj. vršni i pazušni pupoljci (Vi nte r h a l t e r & Vinterhalter 1996). Postupak se zasniva na dodavanju egzogenih citokinina s ciljem aktiviranja postojećih pazušnih pupoljaka, odnosno izazivanja izduživanja njihovih internodija i formiranja listova, a zatim i novih pupoljaka u njihovom pazuhu. Karakteristika metode je u tome da se kulture održavaju kao tzv. “kulture izbojaka”, koje u načelu nemaju korijenov sustav, sve dok se za tim ne ukaže potreba. Za podsticanje ožiljavanja koristi se podloga drukčijeg sastava, obično s auksinima, a eksplantati u ovoj fazi pojedinačni su izbojci isječeni s busenova, koji nakon ožiljavanja predstavljaju pojedinačnu individualnu biljku – rasad. Postupak mikropropagacije razrađen je u prvoj polovici 70-ih godina na voćnim vrstama, a posebno na jagodama i podlogama za razne vrste roda Prunus. Pojava mikropropagacije bila je trijumf primjene metoda in vitro u klonskom razmnožavanju biljaka. Ona je omogućila izuzetno veliku brzinu razmnožavanja, i to tijekom cijele godine, u laboratorijskim uvjetima u kojima je moguće osigurati apsolutnu kontrolu uvjeta rasta i zdravstvenog stanja kultura. U kombinaciji s eliminacijom virusa, putem termoterapije i kulture meristema, mikropropagacija je ponudila skoro savršeno rješenje za savremenu rasadničku proizvodnju. Prvi rezultati bili su povoljni, jer je pokazano da biljke proizvedene ovom kontinualnom kulturom meristema i pupoljaka u potpunosti zadržavaju svoja klonska svojstva i da se ni na koji način ne razlikuju od biljaka proizvedenih klasičnim postupcima. Također, objavljeni su radovi za razne, posebice voćne vrste u kojima je dokazano da su po nizu parametara koji definiraju kvalitetu ne samo sadnica već i plodova, biljke iz epruvete superiornije nad biljkama proizvedenim konvencionalnim putem. Nešto kasnije pojavljuju se i suprotna mišljenja, posebno kada je u pitanju dobivanje i proizvodnja podloga oslobođenih od virusa (virus-free) za različite vrste, kod kojih je primijećena promjena (opadanje) sposobnosti ožiljavanja nakon oslobađanja od virusa. Iako se o tome nije puno pisalo, znalo se da korištenje kalusa i uopće in-vitro tehnika može izazvati pojavu aberantnih (off-type) biljaka, što je krajnje nepoželjno u rasadničkoj proizvodnji, odnosno klonskom razmnožavanju. Međutim, početkom 1980-ih godina prošloga stoljeća L a r ki n i S c o wc r o f t (Vi n t e r ha lt er i Vi n t e r ha l t e r ) ukazali su da varijabilnost nastala tijekom ili kao posljedica korištenja metode kulture in vitro može biti korisna u selekciji i oplemenjivanju. Posebnost je dobila ime “somaklonalno variranje”, pod kojim se podrazumijevaju samo one promjene izazvane u kultiffi in vitro koje postaju nasljedne. Bolje rečeno, samoklonalno variranje je rezultat promjene genotipa, a ne fenotipa. Međutim, metode kulture in vitro izazivaju i fenotipske, epigenetske, odnosno prolazne promjene, koje su za klonsko razmnožavanje neželjene, jer nužno nalažu detaljno ispitivanje prirode i uzroka svoga nastanka. U šumarstvu metode kulture in vitro našle su primjenu i za klonsko razmnožavanje i u selekciji superiornih individua. Mikropropagacija može se koristiti kod čitavog niza dikotiledonih širokolisnih šumskih vrsta, kao što su topole. Drvenaste vrste su puno zahtjevnije i teže se kultiviraju u uvjetima in vitro od zeljastih biljaka, zbog sljedećih razloga: 1) Drvenaste vrste imaju slabiju regeneracijsku mo gućnost u usporedbi sa zeljastim biljkama, 2) Rejuvenilizacija kod drveća je, općenito teža, 3) Stopa umnožavanja mnogo je niža kod drvenastih vrsta, što je povezano njihovim dugotrajnim životnim ciklusom i 4) Drvenaste vrste podložnije su izlučivanju toksičnih tvari u hranjivu podlogu, itd. (J e 1 a s k a 1994). Potrebno je napomenuti da osim primjene u rasadničkoj proizvodnji, klonsko razmnožavanje biljaka metodama kulture in vitro ima značajnu primjenu gdje god se radi selekcija i oplemenjivanje. Mikropropagacija i regeneracija izbojaka teme su za istraživanje i uspješnu primjenu genetičkog inženjeringa kod biljaka. Mikropropagacija primjenjuje se kod: > Brzog razmnožavanja novih genotipova, > Čuvanja (održavanja) interesantnih genotipova, > Ubrzanja, skraćivanja ili dovršavanja postupaka se lekcije i oplemenjivanja te Č Regeneracije izbojaka i cijelih biljaka u genetičkom inženjerstvu. U tablici 1. dana su dva široko rasprostranjena sustava za mikropropagaciju i klonsko razmnožavanje. Jedan od sustava predložio je Murashig e i on obuhvaća ne samo mikropropagaciju u užem smislu (samo iz aksilamih izbojaka), već sve sustave u kojima se kao rezultat in vitro kultiviranja mogu dobiti izbojci. Ovaj sustav pogodan je pri istraživačkom radu. Iz prijedloga Debergh i Maene može se zamijetiti da se ožiljavanje izbojaka ne vrši u uvjetima in |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 28 <-- 28 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 vitro, već se u međufazi IIIa izbojci izdužuju, a potom reznice. Ovaj sustav pogodan je za masovno klonsko isijecaju i postavljaju u zemljišni supstrat kao i zelene razmnožavanje. Tablica 1. Faze mikropropagacije biljnog materijala (Vinterhalter et Vinterhalter 1996). Table 1 Phases of micropropagation of the plant material (Vinterhalter et Vinterhalter 1996). Operacija Murashige, 1974. Debergh i Maene, 1981. Priprema, sakupljanje i transport materijala Faza I Faza 0 Površinska sterilizacija Dobivanje kulture bez očiglednih Higijenski uzgoj biljaka s kojih se Postavljanje primarnih eksplantata zaraza; zadovoljavajući postotak uzimaju eksplantati u uvjetima in vitro preživjelih eksplantata u kulturi; Faza I Provjera na zaraze (kontaminaciju) brz rast eksplantata Uspostavljanje aseptičnih kultura Multiplikacija izbojaka Faza I I Faza I I Adventivna organogeneza izbojaka Indukcija meristemskih centara, Izduživanje izbojaka Stimulacija indukcije njihov razvoj u izbojke aksilarnih izbojaka i multiplikacija Ožiljavanje izbojaka Faza III a Aklimatizacija sadnica Uniformno izduživanje izbojaka Faza III Faza III b Ožiljavanje izdanaka i -ex vitropresađivanje u zemljište Isijecanje izduženih izbojaka, a zatim ožiljavanje i adaptacija tih reznica 2. CILJ ISTRAŽIVANJA – The research goal Cilj istraživanja je uspostavljanje sustava brze multi- ove tehnologije u rasadničkoj proizvodnji i ujedno plikacije, zakorjenjivanja i aklimatizacije eksplantata njena primjena kao modela, u okviru praktičnih vježbi bijele topole (Populus alba L.) na različitim podlogama. predmeta Fiziologija drveća i Kultura in vitro. Na ovaj način bi se omogućila eventualna primjena 3. MATERIJAL I METODE RADA Matherial and methods of work 3.1. Biljni materijal Plant matherial U ovom pokusu biljni materijal su bili eksplantati bijele topole (Populus alba L.) koji su uzgojeni u in vitro uvjetima u Italiji, (Firenze Scienze e Tecnologie Ambientali Forestali). Slika 1. Izbojci bijele topole Picture 1 Sprouts of white poplar 3.2. Autoklaviranje i sterilizacija – Sterilization 3.2.1. Površinska sterilizacija biljnog materijala – Surface sterilization of the herbal material Površinska sterilizacija vrši se s ciljem da se sa po-lizacija treba biti dovoljno jaka, kako bi se eliminirali vršine primarnog eksplantata biljke uklone mikroorgamikroorganizmi, ali da istovremeno ne ubije i sam prinizmi, koji bi prilikom uvođenja eksplantata u kulturu marni eksplantat. in vitro mogli kontaminirati hranjivu podlogu. Steri |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 29 <-- 29 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Površinska sterilizacija izvodi se tako da se vršni i bočni izbojci isijecaju, smiještaju u odgovarajuće flašice i tetiraju sredstvom za površinsku sterilizaciju. U tu svrhu najčešće se koristi 10 % otopina varikine (ili drugog komercijalnog izbjeljivača), koja sadrži 4–6 % Nahipoklorit. Sterilizacija se vrši u Erlenmajer posudama, ili drugim pogodnim staklenim flašicama, koje se prethodno začepe aluminijskom folijom i autoklaviraju. Površinska sterilizacija vrši se u laminarnom, specijalnom radnom prostoru sa sterilnim strujanjem zraka. U staklenu flašicu se pipetom doda kap detrdženta i 10 % otopine varikine. U ovoj fazi rada pipete ne moraju biti sterilne, a biljni materijal može se rukom ubaciti u flašicu sa sredstvom za površinsku sterilizaciju. Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 Lisni materijal potopljen u, ovako pripremljenu otopinu za površinsku sterilizaciju, treba intenzivno promućkati 2–10 minuta, dok je standardno vrijeme za sterilizaciju pupoljaka u trajanju od 20–30 minuta. Po isteku vremena namijenjenog površinskoj sterilizaciji otopina varikine se odlije, zatim se u flašicu nalijeva autoklavirana (sterilizirana) voda. Uobičajeno je da se sterilizirana voda promijeni bar 3 puta u trajanju od 5 minuta u svakoj posudi. Za uspješnost površinske sterilizacije izuzetno je važno da biljni materijal bude svjež. 3.2.2 Autoklaviranje instrumenata – Sterilization Instrumenti (skalpeli, pincete), filter papir i sta- Autoklaviranje je proces koji služi za sterilizaciju kleno laboratorijsko posuđe sterilizirano je u suhom destilirane vode i magenti s podlogama te zaraženih sterilizatoru, u trajanju od 1–3 sata na temperaturi od medija s izbojcima, a vrši se u autoklavu na temperatu180 °C. ri od 120 °C u trajanju od 30 min. 3.3. Priprema hranjive podloge Preparison of nutritious base Tablica 2. Sastav osnovne podloge za multiplikaciju U ovom radu je, kao osnovna podloga, korištena Table 2 Composition of primary base for multiplication modificirana podloga “Woody Plant” (WPM), osim Sastav Makroelementi NH4NO3 KNO3 CaCl2 x 2H20 MgSO4 x 7H2O KH2PO4 Mikroelementi MnSO4x H2O ZnSO4 x H2O H3BO3 Na2MoO4 x H2O CuSO4x 5 H2O Željezo Na2EDTA FeSO4x 7H2O Vitamini Thiamin HCl Nikotinska kiselina Pyridoxin-HCl Glicin Šećeri Myo-inositol Saharoza pH Agar Koncentracija (mg/l) makroelemenata koji su pripremljeni prema recepturi za Murashige i Skoog (MS) podlogu, što se vidi u ta1.650,00 blici 2. (Murashige i Skoog 1962.) 1.900,00 U podlozi za multiplikaciju korištene su dvije 440,00 različite kombinacije biljnih regulatora rasta: 0,5 mg/l 370,00 BA (M1) i 0,25 mg/l BA (M2); dok je podloga za za170,00 korjenjivanje zahtijevala pasažu biljaka na podlozi sa 0,1 mg/l IBA (Z) u trajanju od sedam dana, nakon čega 22,30 su presađene na medij bez hormona (BH) (Tablica 3). 8,60 6,20 Tablica 3. Koncentracije biljnih regulatora rasta u korište 0,25 0,25 Table 3 37,30 Podloga 27,80 Ml M2 1,00 Z 0,50 BH 0,50 2,00 100,00 30.000,00 5,7-6,2 9000 nim podlogama. Concentration of herbal plant growth regulators in used bases Sastav Osnovna podloga Osnovna podloga Osnovna podloga Osnovna podloga BAmg/l IBA mg/l 0,50 / 0,25 / / 0,10 / / 3.4. Rad u laminaru – Laminar work Laminar je komora kroz koju u horizontalnom mogli dospjeti do podloge ili uzorka u procesu inokusmjeru protiče sterilni zrak. Fini filteri ovoga aparata lacije. Laminar posjeduje UV lampe, koje se uključuju zadržavaju sve nepoželjne mikroorganizme, koji bi najmanje jedan sat prije početka rada. |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 30 <-- 30 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 Prije unošenja uzoraka, podlogâ i instrumenata neopRad u laminaru obuhvaća sljedeće faze mikroprohodnih za rad u laminar, potrebno je isključiti UV lampe, pagacije: osigurati cirkulaciju sterilnog zraka barem 15 minuta Obrada brada biljno biljnobiljnogg materijala, prije početka rada, te ruke i radni pult laminara prebrisati 96 % etilnim alkoholom (Međedović 2003). Multiplikacija izbojcima, Unutar laminara nalazi se špiritna lampa i čaša s Izduživanje izbojaka i alkoholom, u kojemu se drže sterilni skalpeli i pincete, Ožiljavanje zbog kontinuiranog steriliziranja na otvorenom plamenu. 3.4.1. Obrada biljnog materijala Processing of the plant material Materijal koji je površinski sterilan i ispran sterilpelom odsijeca ranjeno mjesto gdje je pupoljak bio odnom vodom, treba sterilnom pincetom prenijeti na stesječen prije površinske sterilizacije. Uz to, pupoljcima, rilnu podlogu na dalju obradu, tj. isijecanje skalpelom. bez obzira da li su otvoreni ili ne, treba ukloniti vanjske listiće. U ovoj fazi pupoljci se skraćuju na način da se skal – Multiplication by sprouts 3.4.2. Multiplikacija izbojcima se skraćuje s porastom temperature. Ukoliko želimo Za svaku biljnu vrstu potrebno je empirijski, tj. is produžiti vrijeme trajanja pasaža, kulture možemo pre traživanjem, definirati formulu i balans biljnih hormo nijeti u hladnu sobu ili frižider. na koji će suzbiti pojavu i rast nediferenciranog kalusa Osnovni parametar multiplikacije je tzv. “indeks i favorizirati samo rast vršnog i aksilarnih meristema. multiplikacije”, koji pokazuje prosječan broj novih pu Dominantnu ulogu u regulaciji imaju citokinini (BAP; poljaka koji se tijkom subkulture razvijaju iz jednog 6-benzil aminopurin), kinetin (6-furfuril aminopurin), (pojedinačnog) pupoljka i koji se mogu koristiti kao 2iP (izopentil adenin) i zeatin. Citokinini omogućavaju eksplantati u sljedećem pasažu. Najčešće, medijumi za da se aksilarni pupoljci oslobode apikalne dominacije, multiplikaciju uz citokinin sadrže i jedan auksin, obič odnosno da se slobodno izdužuju. Jednostavnije rečeno IBA, i to u koncentraciji od 0,1–0,2 mg/l, u kojoj no, u fazi multiplikacije koriste se hranjive podloge s IBA potpomaže bolje izduživanje eksplantata. citokininima koji stimuliraju izduživanje svih pupoljaka na eksplantatu. Koncentracija BAP od 0,5 do 1,0 mg/l je optimalna Prosječna dužina trajanja pasaža (subkulture) u fazi za multiplikaciju velikog broja različitih dikotiledonih multiplikacije izbojaka iznosi 4–5 tjedanaa. Ovakve biljaka, jer podloga za multiplikaciju izbojaka treba kulture rastu dok ne utroše sav medijum (podlogu) u omogućavati nesmetani rast i umnožavanje eksplantakoji su posađene. Kod mnogih dikotiledonih vrsta nata, a da istovremeno ne izaziva obilnije kalusiranje. kon 4–5 tjedana trajanja pasaža rast prestaje i kulture se Pouzdano se može reći da je hormonski par počinju sušiti, iako u flašicama ima još uvijek neisko-BAP/IBA najčešće korišteni par hormona u mikroprorištenog medijuma. Dužina trajanja pasaža izravno ovisi pagaciji, posebno kod dikotiledonih vrsta. od temperature komore za gajenje kultura, i to tako što 3.4.3. Izduživanje izbojaka – Sprouts elongation Kod nekih biljnih vrsta preporučuje se da se između biti višestruka, ali uglavnom služi da omogući dovoljfaza multiplikacije i ožiljavanja ubaci jedna međufaza, no dugačke izbojke za fazu ožiljavanja. tzv. faza izduživanja (elongacije). Svrha ove faze može 3.4.4. Ožiljavanje Rooting Za ožiljavanje se koriste izduženi izbojci, obično ne na podlogu za ožiljavanje. manji od 10 mm, koji se isijecaju s busenova i prenose 3.5. Aklimatizacija – Aclimatization Aklimatizacija je završna faza mikropropagacije. U Kod skoro svih dikotiledonih biljaka, listovi forminjoj se ožiljene biljke vade iz posuda, u kojima su bile rani tijekom rasta u in vitro uvjetima ne mogu funkciokultivirane i rasađuju u zemljišni supstrat. Prije same nirati u uvjetima uobičajene, niske relativne vlažnosti sadnje korijenov sustav se vodom ispire od zaostalih zraka, kakva normalno vlada u vanjskoj sredini. čestica agara. Aklimatizacija se upravo i vrši s ciljem da se in vitro sadnica prilagodi toj niskoj vlažnosti zraka. |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 31 <-- 31 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 Aklimatizacija se obično obavlja u plastenicima i staklenicima, a sadnica zasađena u kontejnerima štiti se plastičnom folijom 2 do 4 tjedna, odnosno dok ne krene formiranje novih listova. Što se tiče zemljišnog supstrata u koji se prenose biljke, ožiljene in vitro radi daljeg uzgoja, potrebno je omogućiti takvu mješavinu komponenti koja će dati supstratu sitnu mrvičastu strukturu i dobru aeraciju. U tu svrhu može se koristiti mješavina treseta i pijeska, a po potrebi i perlita. 3.6. Metode rada – Methods Ubičajeni rad odvija se kroz sljedeće faze mikropropagacije: 1. Prikupljanje materijala za mikropropagaciju, 2. Površinska sterilizacija, 3. Obrada biljnog materijala, 4. Uspostavljanje inicijalne kulture, 5. Multiplikacija izbojaka, 6. Izduživanje izbojaka, 7. Ožiljavanje izbojaka i 8. Aklimatizacija. Biljni materijal korišten u ovom eksperimentu potiče iz laboratorije Firenze Scienze e Tecnologie Ambientali Forestali i on je već bio uveden u kulturu, tako da su se u ovom radu izvodili samo postupci pod rednim brojevima 5–8, tj. multiplikacija izbojaka, izduži vanje izbojaka, ožiljavanje izbojaka i njihova aklimatizacija. Naime, biljke su u sterilnim (aseptičnim) uvjetima vađene iz Ewrlenmajer posuda i pomoću skalpela odstranjeni su oštećeni listovi i eventualni kalus. Potom je stabalce segmentirano na pojedinačne eksplantate s barem jednim nodijem, veličine 1–2 cm. Ovako secirani eksplantati su prebacivani na svježu podlogu za multiplikaciju. Prenos eksplantata na svježe podloge vršio se svakih 28–35 dana, što je, zapravo, i predstavljalo vrijeme supkultivacije (pasažiranja). Naime, usporavanje i zaustavljanje rasta eksplantata nastupa zbog osiromašenja hranjiva, sušenja agara, produkcije otrovnih bioproizvoda i smanjenja količine oksigena u unutrašnjosti posude, tako da je potrebno samo zdrava tkiva subkultivirati. Na podlogama za multiplikaciju nastojalo se vršiti umnožavanje izbojaka, tj. indukcija diferencijacije no vih izbojaka iz bočnih pupoljaka. Otprilike, nakon mjesec dana lako su se mogli uočiti i odstraniti novi bočni ogranci od matičnog stabalceta. U Erlenmajer posude, s podlogama za multiplikaciju je inokulirano u prosjeku po deset eksplantata. Dio eksplantata je “žrtvovan” u različitim vremenskim intervalima kako bi se izmjerile i dobile srednje vrijednosti svježe i suhe mase. Masa suhih uzoraka određivana je tako što su se uzorci prvo sušili četiri sata u termostatu na temperaturi od 105 °C. Masa svježih eksplantata, kao i masa suhih eksplantata određivana je na analitičkoj vazi. Po 3–5 izbojaka koji su postigli visinu od 3–4 cm prebacivani su u Erlenmajer posude s podlogom za zakorjenjivanje, a nakon sedam dana u Erlenmajer posude s podlogom bez hormona, što je na kraju rezultiralo pojavom korjenčića i kompletiranjem biljaka. Na ovaj način, dobivene biljčice sa razvijenim korijenovim sustavom su potom presađivane u zemljišni supstrat (sterilna smjesa zemlje i pijeska u omjeru 3:1) i prilagođivani na ex vivo uvjete života. Kulture su održavane u klima komori za rast biljaka, gdje su kontrolirani uvjeti temperature (25–28 °C), relativne vlažnosti zraka (60–80 %), intenziteta svjetlosti (3.000 lx) i fotoperiodizma (16 sati svjetlosti i 8 sati mraka). Zasađene biljčice u teglama bile su prvih sedam dana pokrivene staklenim čašama i redovno zaljevane sterilnom vodom. Tijekom ovih sedam dana čaše su “uklanjane”, u početku par minuta, a kasnije sve duže, dok se osmi dan čaše nisu potpuno uklonile i biljke počele zaljevati nesterilnom vodom. 4. REZULTATI RADA – The results of investigation 4.1. Faza multiplikacije – Multiplication phases Na osnovne podloge za multiplikaciju, modificirani Woody Plant Medium (WPM) uz dodatak 0,25 mg/l BA (M1) ili 0,5 mg/l BA (M2) presađeni su sterilni izbojci i njihovi dijelovi, različitih veličina. Izbojci su presađivani (pasažirani) suksesivno svakih 4–5 tjedana tijekom devet mjeseci izvođenja eksperimenta (od XI 2006. do VI 2007. godine). U ovom periodu zamijećeno je da se izbojci drukčije ponašaju na navedenim podlogama. Naime, zbog pro cjene potencijalne multiplikativnosti i stope multiplikacije date vrste potencijalni eksplantati razdvajani su s matičnog eksplantata i presađivani na novu podlogu. Tijekom prvih pet, od osam pasaža, bila je prisutna umjerena stopa multiplikacije na obje podloge, tako da je na podlozi M1 iznosila 5,36 po eksplantatu, a na podlozi M2 5,86 po eksplantatu. Međutim, u sljedećim pasažama došlo je do značajne promjene, te se broj novih izbojaka po eksplantatu na podlozi M1 smanjio na |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 32 <-- 32 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 Slika 3. Kulture bijele topole nakon četiri sedmice kultiviranja Picture 3 Cultures of white poplar after four weeks of cultivitation Slika 2 Kultura bijele topole u klima komori Picture 2 Culture of white poplar in climate chamber prosječnih 1,8; dok se na podlozi M2 povećao na 13,45 statistički podaci (tablica 4) za stopu rasta biljnog mapo eksplantatu. Izbojci su bili vitalni, normalnog obliterijala u uvjetima in vitro. Iz datih podataka može se ka i boje za bijelu topolu, ali različite visine. vidjeti da izbojci uzgajani na podlozi M1 imali su sred Može se reći da je multiplikacija bila 100 % uspješ-nje vrijednosti prirasta svježe mase od 0,04022 g i suhe M na, i da su novodobiveni izbojci, ovisno o visini, koriš-mase od 0,00888 g, tj. u sljedećem kontrolnom mjereteni za: daljnju multiplikaciju, određivanje svježe i suhe nju srednju vrijednost svježe mase od 0,03588 g i suhe mase eksplantata ili zakorjenjivanje. mase od 0,00630 g. S druge strane, eksplantati na pod lozi M2 su imali srednje vrijednosti svježe mase od Nakon “žrtvovanja” eksplantata i prikupljanja po 0,03851 g, tj. 0,00743 g i suhe mase od 0,02988 g i dataka svježe i suhe mase izračunali su se i osnovni 0,01397 g. Tablica 4. Pregled statističkih vrijednosti svježe i suhe mase eksplantata. Table 4 Review of stastistic values of fresh and dry explantat mass Mjerenje Statistički parametri M1 podloga Svježa masa (g) Suha masa (g) M2 podloga Svježa masa (g) Suha masa (g) Min. 0,00632 0,00063 0,00378 0,00186 Max. 0,10864 0,06729 0,11671 0,01833 1. Stand.dev. 0,02812 0,01417 0,02875 0,00437 Aritm. sred. 0,04022 0,00888 0,03851 0,00743 Koef. var. 0,69924 1,59533 0,74651 0,58763 Min. 0,00738 0,00219 0,00660 0,00146 Max. 0,09248 0,01342 0,09322 0,08566 2. Stand.dev. 0,02058 0,00294 0,02066 0,02129 Aritm. sred. 0,03588 0,00630 0,02988 0,01397 Koef. var. 0,57368 0,16612 0,69142 1,52470 4.2. Faza zakorjenjivanja – Rooting phases Za zakorjenjivanje su se koristile podloge Z (sa 0,1 mg/l IBA) i BH (bez hormona). Naime, u cilju inicijacije formiranja korijenčića su izbojci, veličine 3–4 cm, presađivani na podlogu Z, na kojoj su kultivirani idućih sedam dana. Nakon toga su, ovako tertirani izbojci, ponovo prebacivani na svježu podlogu i to podlogu bez hormona, na kojoj je dolazilo do razvoja korijenovog sustava. Zakorjenjivanje je bilo stopostotno za obje linije multipliciranih izbojaka. Slika 4. Kompletne individue u magenti Slika 5. Kompletna individua Picture 4 Complete individuals in magenta Picture 5 Complete individua |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 33 <-- 33 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 4.3. Faza aklimatizacije U ovoj fazi ožiljene su biljke prenešene iz sterilnih posuda u kojima su bile kultivirane i zasađene u zemljišni supstrat (zemljište i pijesak u omjeru 3:1) izvan klima komore. – Aclimatization phases Naime, korijenov sustav je bio očišćen od čestica podloge s agarom pomoću mlaza sterilne destilirane vode, pa su biljke presađivane u zemljišni supstrat, koji je prethodno steriliziran sa fungicidom. Ove mlade Slika 6. Faza aklimatizacije bijele topole (neposredno pri zasađivanju; nakon sedam dana; nakon tri mjeseca). Picture 6 Aclimatization phase of the white poplar biljke nisu imale dovoljno razvijenu kutikulu, funkcionalan stomatalni aparat, dobru vaskularnu vezu između korijena i izbojka, slabo razvijene korijenske dlačice, itd., te je bilo potrebno postepeno ih navikavati na uvjete ex vivo. To je postignuto privremenom zaštitom mladih biljaka sa sterilnom staklenom čašom, čije otklanjanje je strogo kontrolirano i vremenski se produ užava svaki dan kako bi došlo do razmjene plinova. S druge strane, prvih sedam dana ove su biljke zaljevan sa sterilnom destiliranom vodom, a nakon toga običnom vodom iz vodovodnog sustava. Iako je ova faza često kritična, sve presađene individue aklimatizirale su se na uvjete relativne niske vlažnosti zraka, koji vladaju u vanjskim uvjetima, tj. uvjetima ex vitro. Slika 7. Aklimatizirane bljke bijele topole na uvjete ex vitro. Picture 7 Aclimated plants of white poplar on ex vitro conditions 5. RASPRAVA – Discusion U in vitro uvjetima, a u cilju multiplikacije izbojaka, vrsta Populus alba je vrlo dobro reagirala. Upotrijebljena tehnika multiplikacije u ovom radu bila je učinkovita i brza, te se može široko primjenjivati u mikropropagaciji brzorastuće bijele topole. Stopa multiplikacije na podlozi M1 je iznosila, u prosjeku 5,36, odnosno u iduće tri pasaže samo 1,8 izbojaka po eksplantatu, dok je na podlozi M2 bila dosta drukčija situacija. Naime, stopa multiplikacije je na podlozi M2 u prvih pet pasaža iznosila 5,86, a po tom se povećala na 13,45. Iz dobivenih rezultata moglo se uočiti da je na ponašanje eksplantata bijele topole, u uvjetima in vitro, najviše utjecaja imao balans egzogeno dodatih hormona u podlogu. Dugoročno gledano, u našem eksperimentu, je eksplantatima više odgovarala veća koncentracija BA hormona (0,5 mg/l) u podlozi, jer nije dolazilo ni do kakve vidljive promjene u izgledu izbojaka i stvaranja kalusa, već samo do povećanja brojnosti novih izbojaka, a nakon prosječnih četiri tjedna kultiviranja. |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 34 <-- 34 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Međutim, D o u g l a s et al. (preuzeto iz J e l a s ka 1994) i Međedović et al. (2006) navode da zeatin značajno utječe na regenearciju eksplantata topole, što je Beganović (2001) u svom diplomskom radu, potvrdila ali na materijalu vrste Populus tremula L. Naime, Beganović (2001) je u svom radu izvršila usporedbu ponašanja eksplantata jasike na različitim podlogama i izvijestila da je u njenim pokusima najbolja podloga za multiplikaciju bila WPMZ s dodatkom 1,0 mg/l zeatina, i to čak 50 % u odnosu na MS podlogu s istom količinom ovog hormona rezultatima, što se podudara s podacima koje su naveli Gözükirmizi et al. (1998). U istom radu, Beganović (2001) navodi da je maksimalan broj izbojaka po eksplantatu iznosio 17, dok je u našem eksperimentu iznosio 16. Dobiveni rezultati u ovom radu o stopi multiplikacije donekle se poklapaju i s dobivenim podacima o stopi rasta biljnog materijala. Naime, mjerenjem svježe i suhe mase eksplantata, na obje podloge, moglo se uočiti da su izbojci imali ravnomjeran prirast. Ali, na podlozi M1, iako je došlo do smanjenja broja novih izbojaka po eksplantatu, ipak je došlo do povećanja srednjih vrijednosti masa izbojaka. S druge strane, na podlozi M2 došlo je do smanjenja povećanja mase izbojaka, što se i očekivalo, s obzirom na to da je došlo do znatnog povećanja broja izbojaka po eksplantatu. Očit uzrok uočenoj pojavi je odnos novonastalih individua i nja, . količine pristupačnih hranjivih materija, tj tjtj. prave borbe za prostor i opstanak individua. Chun et al. (1986) navode da na in vitro razmnožavanje Populus alba x Populus grandidentata, tj. masu izbojaka i njihov broj po eksplantatu utiče konzistencija hranjive podloge. Naime, oni su imali znatno bolje rezultate u tečnim nego na čvrstim podlogama, i to skoro u dvostruko većim vrijednostima mjerenih parametara. Isti autori navode da su zamijetili da se 6. ZAKLJUČCI Na temelju dobivenih rezultata multiplikacije, zakorjenjivanja i aklimatizacije, zaključili smo sljedeće: > Uspješno je proveden postupak multiplikacije bije le topole šPopulus alba L.) u in vitro uvjetima, i to na modificiranoj osnovoj podlozi WPM uz dodatak 0,25 mg/l šM1) i 0,5 mg/l šM2) BA. > Stopa multiplikacije je u prvima pasažama bila neš to manja i iznosila je u prosjeku 5,36, odnosno u iduće tri pasaže samo 1,8 izbojaka po eksplantatu (podloga M1), dok je na podlozi M2 iznosila 5,86, a potom se povećala na 13,45. > Mjerenjem svježe i suhe mase eksplantata (stope rasta biljnog materijala) uočilo se da je na podlozi M1 došlo do smanjenja broja novih izbojaka po eksplantatu, ali i do povećanja srednjih vrijednosti masa izbojaka, dok je na podlozi M2 došlo do Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 povećavanjem broja eksplantata po posudi usporava rast eksplantata, smanjuje njihova masa, kao i da nastaje manji broj novih izbojaka. Također, Smith (2000) navodi da svježa masa općenito korelira sa suhom masom, s vrijednostima iznad 0,5 g. U našem radu ostvareno je 100 % zakorijenjivanje jedinki na modificiranoj podlozi WPM uz dodatak 0,1 mg/l IBA, i to u trajanju od sedam dana. Nakon tog razdoblja jedinke su se prebacivale na modificiranu osnovnu podlogu bez hormona, na kojoj je dolazilo do dobrog razvoja korijenovog sustava, što je poslije potpomoglo i odličnu aklimatizaciju biljčica. Gözük i rm iz i et al. (1998) u svom radu navode da je za većinu istraživanih klonova topola WPM sa 0,5 mg/l IBA omogućavala stopostotno zakorjenjivanje biljaka; dok su WPM sa 2 mg/l IBA i 0,1 mg/l NAA bile djelimično uspješne. Began o v ić (2001) je u svojim pokusima najbolje rezultate rizogeneze ostvarila na WPM uz dodatak 0,5 mg/l IBA. Aklimatizacija zakorijenjenih biljaka bila je vrlo uspješna, jer su svi zasađeni primjerci bijele topole u smjesu zemlje i pijeska (omjera 3:1) preživjeli i nastavili s normalnim rastom. Naime, u laboratorij su biljke prenešene u zemljišni supstrat uz kontroliranje razmjene plinova i zaljevanje sterilnom vodom idućih sedam dana. Ovako tretirane biljke uspješno su aktivirale svoje sustave za fotosintezu i transpiraciju, poboljšale vaskularne veze između nadzemnog izdanka i korijena, povećale zaštitini sloj kutikule te izgradile relativno velik broj korijenskih dlačica, što im je omogućilo brzu prilagodbu na ex vitro uvjete. Tijekom eksperimenta, na biljnom materijalu nisu primijećene fenotipske promjene, kako u uvjetima in vitro tako ni u uvjetima in vivo. -Conclusions smanjenja povećanja mase izbojaka i znatnog povećanja broja izbojaka po eksplantatu. > Ostvareno je 100 % zakorijenjivanje jedinki na modificiranoj podlozi WPM uz dodatak 0,1 mg/l IBA. Nakon sedam dana jedinke su s ove podloge prebacivane na modificiranu osnovnu podlogu bez hormona na kojoj se razvijao korijenov sustav u iduća tri tjedna. > Aklimatizacija zakorijenjenih biljaka bila je uspješna, jer su svi zasađeni primjerci bijele topole u smjesu zemlje i pijeska (omjera 3:1) preživjeli i nastavili s normalnim rastom. > Tijekom eksperimenta, na biljnom materijalu nisu primijećene fenotipske promjene, kako u uvjetima in vitro tako ni u uvjetima in vivo. |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 35 <-- 35 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 7. LITERATURA – References Beganović, S. 2001. Klonska propagacija topole Međedović, S., Dž. Ferhatović, 2003. Klonska (Populus tremula L.) u kulturi in vitro. Diplom- proizvodnja sadnica drveća i grmlja. Bemust, ski rad. Univerzitet u Sarajevu, Sarajevo. Sarajevo. Chun, Y. W., R. B. Hall, L. C. Stephens, 1986. Smith, R. H., 2000. Plant tissue culture. Techniques Influences of medium consistency and shoot and experiments. Second edition. Academic density on in vitro shoot proliferation of Populus Press. alba × P. grandidentata. Plant cell, tissue and Vin t e r h a l t e r, D., B. Vi n te r ha lt er, 1996. Kultuorgan culture, 5(3): 179–185. ra in vitro i mikropropagacija biljaka, Axial, Gözükirmizi, N., K. Bajrović, Z. Ipecki, M. Beograd. Boydak, T. Akalp, K. Tunctaner, H. ™eograd.,,/gatunki/Populus_alba.htm Balkan, H., Tanriyar, M. Calikoglu, T. www.fichas.infojardin.com/arboles/populus-alba- Ogras, Ö. Özden, M. Tulukcu, T. Tank, 1998. Genotype differencies in direct plant rege alamo-blanka-chopo-blanca.htm neration from stem explants of Populus tremula www.terra.hu/haznar/htm/Populus.alba.html in Turkey. J. For. Res. 3: 123–126. Je la s k a , S., 1994. Kultura biljnih stanica i tkiva, Školska knjiga, Zagreb. SUMMARY: The plant material used in this experiment derives from the laboratory Firenza Scienza e Tecnologia Ambientali Forestali. It had already been introduced into the culture so that in this paper we only conducted the procedures of shoot multiplication, shoot lengthening, shoot restoration and their acclimatization. Namely, the plants were taken from Erlenmeyer flasks in sterile (aseptic) conditions. The damaged leaves and the callus were removed with a scalpel. The tree was then segmented into individual explants with at least one node of 1–2 cm. The dissected explants were transferred to the fresh multiplication medium. The culture was multiplied in the basic medium: modified Woody Plant Medium (WPM; MS /Murashige and Skoog/ macroelements, WPM – microelements and vitamins) with the addition of 0.25 or 0.5 mg/l BA (6-benzyladenine). The explants were transferred to fresh mediums every 28–35 days, which in fact represented the subcultivation period (passaging) during the nine- month duration of the experiment (from November 2006 to June 2007). The growth of the explants was slowed or halted due to impoverished nutrients, the drying of the agar, the production of poisonous bioproducts and lower quantity of oxygen in the flask. Therefore, only the healthy tissue was subcultivated. The shoots were multiplied in multiplication mediums; in other words, new shoots were differentiated by induction from lateral buds. Approximately one month later new lateral branches could easily be identified and removed from the parent tree. At this period it was noticed that the shoots behaved differently in the mentioned mediums. In order to assess potential multiplication and the multiplication rate of a given species, the potential explants were separated from the parent explant and transferred to the new medium. The shoot multiplication rate in these mediums varied and amounted to 5.36 per explant for M1 medium and to 5.86 for M2 medium during the first five passages. However, in the subsequent passages the lines were clearly separated and the number of new shoots per explant on M1 medium dropped to the average 1.8; whereas it rose to 13.45 per explant on M2 medium. The growth rate of the plant material of white poplar under in vitro conditions was proportionate to the multiplication rate in both types of multiplica |
ŠUMARSKI LIST 7-8/2008 str. 36 <-- 36 --> PDF |
B. Pintarić: MIKROPROPAGACIJA BIJELE TOPOLE (Populus alba L.) Šumarski list br. 7–8, CXXXII (2008), 343-354 tion mediums. However, plant growth rate in M1 medium was more distinct compared to M2 medium, where this relationship changed very quickly and clearly in the three following passages. Thus, the M2 medium proved superior for long-lasting use of these explants under in vitro cultures. A part of the explants was “sacrificed” at different time intervals in order to obtain and measure mean fresh and dry mass values. After “sacrificing” the explants and collecting fresh and dry mass data, some basic statistical data were calculated (Table 4) for the growth rate of the plant material under in vitro conditions. According to the data, the shoots cultivated in the M1 medium had mean fresh mass values of 0.04022 g and dry mass of 0.00888 g. The subsequent control measurements showed the mean fresh mass value of 0.03588 g and dry mass value of 0.00630 g. On the other hand, the explants cultivated in the M2 medium showed fresh mass values of 0.03851 g and 0.00743 g and dry mass values of 0.02988 g and 0.01397 g. Isolated shoots sized about 3-4 cm showed 100 % rooting under in vitro conditions after being planted into the rooting medium (Z) with the addition of 0.1 mg/l IBA (Indol Butric Acid) for seven days and their transplanting into the basic hormone-free medium (BH) in the following tree weeks. In the acclimatization stage, the rooted plants were transferred from the sterile containers in which they were cultivated into the soil substrate (soil and sand at 3:1 ratio) outside the chamber climate. The root system was cleaned from the medium particles with agar using a spray of sterile distilled water. The plants were transplanted into the soil substrate previously sterilized with fungicide. These young plants did not have a sufficiently developed cuticula, a functional stomatal apparatus, a good vascular connection between the root and the shoot, well developed root hairs, etc., so it was necessary to acclimatize them gradually to the ex vivo conditions. This was achieved with temporary protection of the young plants with sterile glass containers. The removal of the containers was strictly controlled and the period of removal was lengthened every day in order to enable gas exchange. On the other hand, for the first seven days the plants were watered with sterile distilled water and after that with tap water. Although this is usually a critical stage, all the transplanted individuals managed to acclimatize to relatively low air humidity prevailing in external conditions (ex vitro conditions). No phenotypal changes were observed on the o pplant material either in in vitro or i iin nn vivo conditions during the experiment. |