DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 32 <-- 32 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 Određivanje veličine fragmenata – Detection of fragment sizes Produkti dobiveni lančanom reakcijom polimeraze analizirani su uređajem 2100 Bioanalyzer tvrtke Agilent Technologies (Slika 6.). Slika 6. 2100 Bioanalyzer tvrtke Agilent Technologies Figure 6 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies Analiza se odvijala na “chipu” (DNA 1000 lab-chip kit) na koji se stavi gel, boja koja se veže na DNAi 1 µl uzorka umnožene DNA. U jednu od jažica stavi se lje stvica (ladder) koja sadrži fragmente DNA poznatih veličina od 25 pb* do 1,5 kb**. U sve ostale jažice stavlja se unutrašnji biljeg od 25 pb i 1,5 kb. Uređaj sadržava detektor koji registrira vrijeme izlaska molekule DNA. Na osnovi veličine fragmenata u jažici s ljestvicom i vremena njihova izlaska, uređaj računa veličinu molekula DNA u uzorcima. Biljeg u uzorcima pomaže njihovu pravilnom smještanju u raspon od 25 do 1500 pb. Uređaj bilježi veličinu svakog od fragmenata u parovima baza te može simulirati i izgled gela. Lančanom reakcijom polimeraze (PCR) umnožen je po jedan fragment DNA u svakom uzorku. Na osnovi veličine umnoženog fragmenta određen je haplotip jedinke u skladu s prethodnim istraživanjem (Lie pe l t i sur. 2002, Gömöry i sur. 2004). Veći fragment označen je brojem 1, a manji brojem 2. Kod određenog broja uzoraka utvrđen je novi fragment od približno 450 pb, kojem je naknadno određen slijed nukleotida označen je brojem 3. Fragment 3 sekvenciran je u laboratoriju VBCGENOMICS GmbH u Beču. Pretragom javne baze podataka Entrez Nucleotide na internet stranicama NCBI-a (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) određena je vrsta kojoj pripada navedeni fragment. REZULTATI I RASPRAVA Od dvadeset sedam obrađenih provenijencija obične jele iz Hrvatske i Slovenije, deset ih sadržava samo dulji fragment (Rudač, Bistranska gora, Djedovica- Trešnjevica, Mašun, Podturen, Gospić, Donji Lapac, Korenica, NP Plitvička jezera i Gračac-Velebit). Dulji fragment odnosno alel 1, karakterističan je za središnju i zapadnu Europu. Samo kraći fragment (alel 2) karakterističan za jugoistočnu Europu nalazimo u devet populacija (Gluhe Drage, Belevine, Nadžak bilo, Biokovo, Brloško, Rudač 2a, Alilovica, Rastovka i Duliba). Šest provenijencija: Zapadni Papuk, Rudnik, Josipovac, Potočine Crna kosa, Miletka i Gračac-Lička Plješivica sadržavaju oba haplotipa. U njima u različitim omjerima nalazimo oba alela. Odstupanje je dobiveno za šest uzoraka iz populacije Macelj i za jedan uzorak iz populacije Trakošćan. Prosječan broj parova baza dobivenog fragmenta iznosio je približno 450 pb. Utvrđivanjem slijeda nukleotida toga fragmenta i usporedbom s podacima iz baze podataka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) ustanovljeno je da 450 pb dugi fragment odgovara fragmentu Nad5-4 kavkaske jele. * pb = par baza; ** kb = kilo baza = 1000 pb Results and discussion Na Slici 6. dan je prikaz slijeda nukleotida četvrtog introna pete podjedinice NAD dehidrogenaze (nad 5-4). Razlika u duljini fragmenata haplotipa 2 i haplotipa 1 je 80 pb (Slika 7.). Na prikazu slijeda nukleotida insercija je označena crvenom bojom. A. nordmanniana ima dodatnu sekvencu, na prikazu označenu plavom bojom, ubačenu (insertiranu) neposredno iza insercije haplotipa 1. Obje insercije započinju sekvencom tagatatat. |