DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 31 <-- 31 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 Tablica 3. Priprema 2x pufera Table 3 Preparation of 2x buffer tvar konc. matične otopine volumen substance conc. of stock solution volume PCR pufer MgClj mješavina dNTP BSA dH20 ukupni volumen total volume lOx 25 mM 10 mM za svaki dNTP 10,08 mg/ml - 200 (iL 144 (iL 20 (iL 39,68 (iL 596,32 (iL 1000 , L 2x pufer pripremljen je razrjeđenjem 10x pufera uz dodatak magnezijev-klorida i goveđeg serumskog albumina (BSA). Postupak pripreme iz matičnih otopina opisan je u Tablici 4. (10x pufer i MgCl2 dobiju se u kompletu s polimerazom). Lančana reakcija polimerazom (PCR) provedena je uređajem PTC-100 (Programmable Thermal Controller) tvrtke MJ Research, Inc. (Slika 4.). Tablica 4. Sastav otopine za odvijanje lančane reakcije poli merazom za jedan uzorak Table 4 Composition of PCR solution, for one sample Tvar Količina substance volume 2x pufer 12,5 (iL početnica 1 2,4 (iL početnica 2 2,4 (iL Taq DNApolimeraza, 5U/(il 0,05 (iL dHjO 2,65 (iL otopina DNA 5(iL ukupni volumen 25 (iL total volume Programiranje uređaja za PCR obavljeno je prema L i e p e l t u i sur. (2002). Prvi je korak denaturacija u trajanju od 3 minute na 94 °C da bi se razdvojili lanci DNA. Nakon toga slijedilo je 30 ciklusa umnožavanja koji su se sastojali od tri koraka: razdvajanje dvostruke uzvojnice DNA (1 min na 92 °C, eng. denaturation) vezanje početnica na razdvojene DNA lance (1 min na 52,5 °C, eng. annealing) sinteza novog lanca DNA (1 min 20 s na 72 °C, eng. elongation). Nakon 30 ciklusa slijedi zadnji tzv. elongacijski korak od 8 min na 72 °C, kako bi se do kraja sintetizirali fragmenti koji to nisu stigli za vrijeme prethodnih ciklusa. Slika 4. Uređaj za provođenje PCR-a Figure 4 PCR machine Kvalitetu umnožavanja provjerili smo na 1 %-tnom gelu agaroze (Slika 5.). Produkti amplifikacije čuvani su na 4 °C do analize. Lančanom reakcijom polimerazom umnožen je fragment mitohondrijskoga gena za četvrti intron pete podjedinice NAD dehidrogenaze (nad5-4). Slika 5. Provjera PCR-a na gelu agaroze Figure 5 Checking of PCR fragment(s) on agarose gel |