DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 36 <-- 36 --> PDF |
538 |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 34 <-- 34 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 nova uzorka provenijencije Macelj jedan uzorak odgovara kavkaskoj jeli, dok mtDNA druga dva uzorka odgovara haplotipu 2 obične jele. Za uzorak iz Trakošćana i uzorak iz Macelja koji je fenotipski sličan običnoj jeli, a dužina umnoženog fragmenta mtDNA odgovara kavkaskoj jeli (mtDNA nasljeđuje se isključivo po majci), možemo zaključiti da se radi o hibridu A. nordmanniana × A. alba. Kako je u ovom radu analizirana samo mtDNA, ne možemo isključiti postojanje još većeg broja hibrida koje bismo možda otkrili analizirajući cpDNA, jer se cpDNA četinjača nasljeđuje po očinskoj liniji. Također, nemožemo isključiti ni eventualnu introgresiju gena kavkaske jele u genom obične jele, do koje je moglo doći križanjem spontanih hibrida sa čistom običnom jelom. Slika 8. Postotni udio haplotipova alela 2 i alela 3 (kavkaske jele) u populacijama Trakošćan i Macelj Figure 8 Percentages of haplotypes of alels 2 and 3 (kavkaske jele) in Trakošćan and Macelj populations Iz svega navedenog nameće se vrlo važan zaključak o primjenjivosti molekularnih metoda u šumarskim istraživanjima, očuvanju genofonda, konzervaciji – očuvanju (in-situ i ex-situ) kao i u operativnom šumarstvu – sjemenarstvu (kontroli sjemena) i rasadničarstvu (kontrola sadnog materijala). Također, molekularne metode istraživanja bile bi neophodne kod izrada studija utjecaja alohtone vrste koja se spontano križa s autohtonom vrstom, dakle, kod izučavanja introgresije gena strane vrste prilikom spontane hibridizacije te utjecaja na okoliš, u prvom redu na šumske ekosustave Republike Hrvatske. Pogotovo kada je riječ o unesenoj vrsti (kavkaska jela) otpornijoj od autohtone vrste (obična jela) na sušu koja je s obzirom na klimatske promjene u adaptacijskoj prednosti. A. nordmanniana obilno plodonosi i to već u dobi od 30 do 40 godina. Puni joj je urod svake 2–3 godine, dok obična ZAKLJUČCI 1. Molekulama analiza mtDNA obične jele (Abies alba Mill.) gena nad5-4, utvrdila su u hrvatskim provenijencijama postojanje haplotipa 1, karakterističnog za srednju i zapadnu Europu, i haplotipa 2, karakterističnog za jugoistočnu Europu. U dvije istraživane slovenske provenijencije pronađen je samo haplotip 1. 2. Ovim istraživanjem u populacijama Trakošćan i Macelj evidentirani su hibridi kavkaske i obične jele (A. nordmanniana x A. alba). Ovi hibridi nastajela počinje cvasti između 60. i 70. godine s punim urodom svake treće do osme godine. Tome u prilog idu i najnovija istraživanja (Zi eg en- h a g en i sur. 2005) na identifikaciji 9 srodnih vrsta roda Abies upotrebom nad5-4 introna, koji smo koristili i u ovim istraživanjima. Navedena istraživanja provedena su na sljedećim vrstama Abies alba, A. bornmuelleriana, A. cephalonica, A. cilicica, A. concolor, A. nordmanniana, A. equi-trojana, A. numidica i A. pinsapo. I dok se danas vrlo često postavlja pitanje o utjecaju GMO (genetski modificiranih organizama) na okoliš, o takvim ili sličnim problemima, gdje je autohtona vegetacija na neki način inferiorna alohtonoj vegetaciji, uopće se ne vodi računa. Na temelju vrlo dostupnih molekularnih analiza mogla bi se istražiti introgresija gena kavkaske jele u Maceljskom gorju, te bi se takav način istraživanja mogao primijeniti i na druge slične probleme. Conclusions li su spontanim križanjem unešene kavkaske jele s domaćom običnom jelom. 3. Primjenjivosti molekularnih metoda u šumarskim istraživanjima, očuvanju genofonda, sjemenarstvu i rasadničarstvu je neupitna. Ovim istraživanjem pokazalo se također, da su molekularne metode vrlo korisne kod izrada studija utjecaja alohtone vrste, koja se spontano križa s autohtonom vrstom, odnosno prilikom izučavanja introgresije gena strane vrste u šumske ekosustave Republike Hrvatske. |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 33 <-- 33 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 Slika 7. Prikaz slijeda nukleotida 4. introna 5. podjedinice NAD dehidrogenaze (nad5-4) obične jele (Abies alba Mill.) i kavkaske jele (Abies nordmanniana Spach.). Sekvencirani fragment prikazan je velikim tiskanim slovima. Početnice su označene svijetlo smeđom bojom i masno otisnute. Sekvence koje predstavljaju insercije u odnosu na haplotip 2 označene su crvenom, odnosno plavom bojom. Sekvenca tagatatat kojom počinje insercija označena je zelenim kvadratom. hap 1 = haplotip 1 obične jele; dulji fragment 275 pb hap 2 = haplotip 2 obične jele; kraći fragment 180 pb hap 3 = haplotip 3 kavkaske jele; dobiveni fragment od približno 450 pb nord = haplotip kavkaske jele (prepisano iz baze “Entrez») naveden zbog usporedbe Figure 7 Nucleotid sequence of 4. intron 5. subunit of NAD dehydrogenase (nad5-4) gene of silver fir (Abies alba Mill.) and Nordmann fir (Abies nordmanniana Spach.). Sequenced phragment is represented by bold capital letters. Primers are bold, light brown. Inserted sequences (insertions) relative to haplotype 2 are marked red and blue respectively (koja kako?). Sequence tagatatat is the beginning of insertion and is demonstrated by green square. hap 1 = haplotype 1 of silver fir; larger fragment 275 bp hap 2 = haplotype 2 of silver fir; shorter fragment 180 bp hap 3 = haplotype 3 kavkaske fir; fragment of aproxymately (ili app.) 450 bp nord = haplotype of kavkaske fir (from “Entrez” base) for comparison Pojava spontane hibridizacije A nordmanniana x A alba Apereance of spontaneous hibridisation ofA. nordmanniana × A. alba Kod provenijencija Macelj i Trakošćan u određenim mtDNA kavkaske jele, koje joj i fenotipski više odgova uzorcima dobiven je prosječan broj parova baza ampli-raju. U populaciji Trakošćan omjer je bio 1 : 4 (Slika 8.). ficiranog fragmenta od približno 450 pb. Za sve prvotno Uzorci s Trakošćana i novi uzorci populacije Macelj u analizirane uzorke iz populacije Macelj utvrđene su potpunosti fenotipski odgovaraju običnoj jeli. Od tri |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 32 <-- 32 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 Određivanje veličine fragmenata – Detection of fragment sizes Produkti dobiveni lančanom reakcijom polimeraze analizirani su uređajem 2100 Bioanalyzer tvrtke Agilent Technologies (Slika 6.). Slika 6. 2100 Bioanalyzer tvrtke Agilent Technologies Figure 6 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies Analiza se odvijala na “chipu” (DNA 1000 lab-chip kit) na koji se stavi gel, boja koja se veže na DNAi 1 µl uzorka umnožene DNA. U jednu od jažica stavi se lje stvica (ladder) koja sadrži fragmente DNA poznatih veličina od 25 pb* do 1,5 kb**. U sve ostale jažice stavlja se unutrašnji biljeg od 25 pb i 1,5 kb. Uređaj sadržava detektor koji registrira vrijeme izlaska molekule DNA. Na osnovi veličine fragmenata u jažici s ljestvicom i vremena njihova izlaska, uređaj računa veličinu molekula DNA u uzorcima. Biljeg u uzorcima pomaže njihovu pravilnom smještanju u raspon od 25 do 1500 pb. Uređaj bilježi veličinu svakog od fragmenata u parovima baza te može simulirati i izgled gela. Lančanom reakcijom polimeraze (PCR) umnožen je po jedan fragment DNA u svakom uzorku. Na osnovi veličine umnoženog fragmenta određen je haplotip jedinke u skladu s prethodnim istraživanjem (Lie pe l t i sur. 2002, Gömöry i sur. 2004). Veći fragment označen je brojem 1, a manji brojem 2. Kod određenog broja uzoraka utvrđen je novi fragment od približno 450 pb, kojem je naknadno određen slijed nukleotida označen je brojem 3. Fragment 3 sekvenciran je u laboratoriju VBCGENOMICS GmbH u Beču. Pretragom javne baze podataka Entrez Nucleotide na internet stranicama NCBI-a (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) određena je vrsta kojoj pripada navedeni fragment. REZULTATI I RASPRAVA Od dvadeset sedam obrađenih provenijencija obične jele iz Hrvatske i Slovenije, deset ih sadržava samo dulji fragment (Rudač, Bistranska gora, Djedovica- Trešnjevica, Mašun, Podturen, Gospić, Donji Lapac, Korenica, NP Plitvička jezera i Gračac-Velebit). Dulji fragment odnosno alel 1, karakterističan je za središnju i zapadnu Europu. Samo kraći fragment (alel 2) karakterističan za jugoistočnu Europu nalazimo u devet populacija (Gluhe Drage, Belevine, Nadžak bilo, Biokovo, Brloško, Rudač 2a, Alilovica, Rastovka i Duliba). Šest provenijencija: Zapadni Papuk, Rudnik, Josipovac, Potočine Crna kosa, Miletka i Gračac-Lička Plješivica sadržavaju oba haplotipa. U njima u različitim omjerima nalazimo oba alela. Odstupanje je dobiveno za šest uzoraka iz populacije Macelj i za jedan uzorak iz populacije Trakošćan. Prosječan broj parova baza dobivenog fragmenta iznosio je približno 450 pb. Utvrđivanjem slijeda nukleotida toga fragmenta i usporedbom s podacima iz baze podataka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) ustanovljeno je da 450 pb dugi fragment odgovara fragmentu Nad5-4 kavkaske jele. * pb = par baza; ** kb = kilo baza = 1000 pb Results and discussion Na Slici 6. dan je prikaz slijeda nukleotida četvrtog introna pete podjedinice NAD dehidrogenaze (nad 5-4). Razlika u duljini fragmenata haplotipa 2 i haplotipa 1 je 80 pb (Slika 7.). Na prikazu slijeda nukleotida insercija je označena crvenom bojom. A. nordmanniana ima dodatnu sekvencu, na prikazu označenu plavom bojom, ubačenu (insertiranu) neposredno iza insercije haplotipa 1. Obje insercije započinju sekvencom tagatatat. |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 31 <-- 31 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 Tablica 3. Priprema 2x pufera Table 3 Preparation of 2x buffer tvar konc. matične otopine volumen substance conc. of stock solution volume PCR pufer MgClj mješavina dNTP BSA dH20 ukupni volumen total volume lOx 25 mM 10 mM za svaki dNTP 10,08 mg/ml - 200 (iL 144 (iL 20 (iL 39,68 (iL 596,32 (iL 1000 , L 2x pufer pripremljen je razrjeđenjem 10x pufera uz dodatak magnezijev-klorida i goveđeg serumskog albumina (BSA). Postupak pripreme iz matičnih otopina opisan je u Tablici 4. (10x pufer i MgCl2 dobiju se u kompletu s polimerazom). Lančana reakcija polimerazom (PCR) provedena je uređajem PTC-100 (Programmable Thermal Controller) tvrtke MJ Research, Inc. (Slika 4.). Tablica 4. Sastav otopine za odvijanje lančane reakcije poli merazom za jedan uzorak Table 4 Composition of PCR solution, for one sample Tvar Količina substance volume 2x pufer 12,5 (iL početnica 1 2,4 (iL početnica 2 2,4 (iL Taq DNApolimeraza, 5U/(il 0,05 (iL dHjO 2,65 (iL otopina DNA 5(iL ukupni volumen 25 (iL total volume Programiranje uređaja za PCR obavljeno je prema L i e p e l t u i sur. (2002). Prvi je korak denaturacija u trajanju od 3 minute na 94 °C da bi se razdvojili lanci DNA. Nakon toga slijedilo je 30 ciklusa umnožavanja koji su se sastojali od tri koraka: razdvajanje dvostruke uzvojnice DNA (1 min na 92 °C, eng. denaturation) vezanje početnica na razdvojene DNA lance (1 min na 52,5 °C, eng. annealing) sinteza novog lanca DNA (1 min 20 s na 72 °C, eng. elongation). Nakon 30 ciklusa slijedi zadnji tzv. elongacijski korak od 8 min na 72 °C, kako bi se do kraja sintetizirali fragmenti koji to nisu stigli za vrijeme prethodnih ciklusa. Slika 4. Uređaj za provođenje PCR-a Figure 4 PCR machine Kvalitetu umnožavanja provjerili smo na 1 %-tnom gelu agaroze (Slika 5.). Produkti amplifikacije čuvani su na 4 °C do analize. Lančanom reakcijom polimerazom umnožen je fragment mitohondrijskoga gena za četvrti intron pete podjedinice NAD dehidrogenaze (nad5-4). Slika 5. Provjera PCR-a na gelu agaroze Figure 5 Checking of PCR fragment(s) on agarose gel |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 35 <-- 35 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 LITERATURA – References B al l ia n, D., D. K a j b a , 2005: Estimation of the isoenzyme genetic variability of the silver fir (Abies alba Mill.) from the area of Gorski kotar (Croatia). Periodicum biologorum Vol. 107, No. 1 67–72. Buchanan, B. B., W. Gruissem, R. L. Jones, 2001: Biochemistry & Molecular Biology of Plants, American Society of Plant Physiologists; Rockville, Maryland. Doyle, J. J., J. L. Doyle, 1987: A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue, Phytochemistry Bulletin 19:11–15. Dumolin-Lape gue, M.-H. Pemonge, R. J. Petit , 1998: Association Between Chloroplast and Mitochondrial Lineages in Oaks; Mol. Biol. Evol. 15 (10): 1321–1331. F r a n j ić , J., Z. L i b e r , 2001: Molekularna biologija u šumarstvu. Šumarski list. 9–10/2001 Zagreb, 495–500. Gömoöry, D., R. Longauer, S. Liepelt, D. B a l l i a n , R. Bru s , H. K r a i g h e r , V. I. P a r pan, Taras V. Parpan, L. Paule, V. I. Stu- par, B. Ziegenhagen, 2004: Variation patterns of mitochondrial DNA of Abies alba Mill. Insuture zones of postglacial migration in Europe. Acta Societatis Botanicorum Poloniae Vol. 73, No. 3: 203–206, 2004. Gračan, J., 2001: Dostignuća na oplemenjivanju obične jele; Obična jela u Hrvatskoj. Akademija šumarskih znanosti i “Hrvatske šume” PO Zagreb: 334–338, Zagreb. I v a n ko v i ć , M., 2003: Varijabilnost nekih svojstava obične jele (Abies alba Mill.) u pokusu provenijencija »Brloško»; Magistarski rad, Šumarski fakultet, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb 2003. K o r mut ž ak, A., 1997: Cytological aspects of interspecific hybridization in true firs (Abies species). Cytogenetic studies of forest trees and shrub spe cies Eds Ž. Borzan & Schlarbaum S.E. Proc. First IUFRO Cytogenetics Working Party S2. 04–08, 1993 Brijuni National Park Croatia 303–310. Kormutžak, A., B. Vookova, 2001: Early growth characteristics of some Abies hybrids. In: Genetic Response of Forest Systems to Changing Enviromental Conditions (Eds. Muller-Starck, M., Schubert, R) Kluwer Academic Publishers, London- Dordrecht-Boston-London, 331–338. Li e p e l t, L., R. B i a l o z y t , B. z i e g e n h a g e n , 2002: Wind-dispersed pollen mediates postglacial gene flow among refugia. Matić, S., 2001: Proslov; Obična jela u Hrvatskoj. Akademija šumarskih znanosti i “Hrvatske šume” p o Zagreb: Zagreb, 5–8. Prpić, B., 2001: Uvod; Obična jela u Hrvatskoj. Akademija šumarskih znanosti i “Hrvatske šume” p o Zagreb: 12–17. Salaj, J., A. Kosová, A. Kormuták, B. Walles, 1998: Ultrastructural and molecular study of plastid inheritance in Abies alba and some Abies hybrids, Sexual Plant Reproduction, 11 (5): 284–291. Vidaković, M., 1993: Četinjače – morfologija i varijabilnost. II prošireno izdanje Grafički zavod Hrvatske i “Hrvatske šume”, p o Zagreb. Vidaković, M. i J. Franjić, 2004: Golosjemenjače. Udžbenici Sveučilišta u Zagrebu, Šumarski fakultet, Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb 2004. Vookova, B., A. Kormutak, 2003: Plantlet Regeneration in Abies cilicica Carr. And Abies cilicica x Abies nordmanianna Hybrid via Somatic Embryogenesis. Turk J Bot 27 (2003) 71–76. Ziegenhagen, B., B. Fady, V. Kuhlenkamp, S. Liepelt, 2005: Diferentiating Groups of Abies Species With a Simple Molecular Marker. Silvae Genetica 54 (3): 123-126. SUMMARY: European fir (Abies alba Mill.) is one of the most significant forest species of the Republic of Croatia. This paper presents research results of variability of mitohondrial DNA (mtDNA) fragment nad5-4. By the use of molecular methods and PCR, two halotypes of European fir were found within the distribution range for this species in Croatia and a part of Slovenia. In provenances Macelj and Trakošćan, haplotypes of Nordmann’s silver fir (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) were found and it is most likely that it was introduced by planting of seedlings and that further introgression of Nordmann´s silver fir genes into local population occurred through random cross-breeding with European fir. |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 30 <-- 30 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 Tablica 2. Sastav ekstrakcijskog pufera Table 2 Composition of extraction buffer o posi Tvar substance ATMAB NaCl 5 M EDTA0,5 M, pH-8,0 Tris HCl 1 M, pH-8,0 PVP dH O Ditiotreitol* r Količina quantity 20 g 280 mL 40 mL 100 mL lO do 1 L 0,3 g na 40 mL pufera * Ditiotreitol je dodan nakon autoklaviranja, jer se autoklaviranjem raspada. – Dithiotreitol is added after autoclaving, because it is otherwise degraded. Centrifugiranjem na 13000 okretaja u trajanju od 10 minuta odvojile su se tri faze: gornja vodena, srednja s čvr- Slika 2. Odvojene tri faze nakon centrifugiranja na 13000 okretaja u minuti Figure 2 3 separated phases after centrifugation on 1300 rpm Slika 3. Istaložene molekule nukleinskih kiselina Figure 3 Pelet of nucleic acids stim ostacima stanica i tkiva, te donja faza u kojoj je diklormetan (Slika 2.). Gornja, vodena faza otpipetirana je u čistu epruvetu. Zbog ostataka smole u vodenoj fazi postupak odjeljivanja diklormetanom proveden je dva puta. Vodenoj fazi je dodano 2/3 volumena (400–450 µl) hladnog izopropanola (–20 °C). Otopina je inkubirana 60 min na –20 °C, nakon čega su se centrifugiranjem na 13000 okretaja po minuti u trajanju od 10 min istaložile molekule nukleinskih kiselina (Slika 3.). Tekuća je faza izdvojena iz epruvete, a talog nukleinskih kiselina ispran s 1 ml 76 %-tnog etanola. Nakon 45 minuta sušenja dodano je 105 µl sterilizirane deionizirane vode. Tako dobivena matična otopina nukleinskih kiselina (stock solution) čuvana je na –20 °C. Prisutnost RNA molekula zajedno s DNA molekulama nije smetala pri daljnjoj analizi. Lančana reakcija polimerazom (PCR) - Polymerase chain reaction (PCR) Lančana reakcija polimerazom (PCR) jedna je od tehnika molekularne biologije koja se koristi za umnožavanje određenog dijela DNA. Sam postupak odvija se u posebno izrađenim uređajima, koji reakcijsku otopinu zagrijavaju i hlade na određene temperature u određeno vrijeme i u točno određenim ciklusima. Postupak ne bi bio moguć bez termostabilnih polimeraza koje se izoliraju iz termofilnih mikroorganizama. Najčešće korištena termostabilna polimeraza je Taq (polimeraza izolirana iz bakterije Thermus aquaticus). Radi se o termofilnoj bakteriji prvotno pronađenoj u Yellowstone- u, čiji je životni optimum na 70 C (50 C – 80 C) oo o (www.bact.wisc.edu/Bact303/b27). Postupak odvijanja PCR-a je sljedeći: U 95 µl sterilne destilirane vode dodano je pet µl matične otopine nukleinskih kiselina (5 % razrjeđenje). Otopina za umnožavanje DNA fragmenata sadržavala je: > početnice za nad5-4 fragment .Ta q DNApolimerazu Čdeioniziranu vodu i Č razrijeđenu otopinu nukleinskih kiselina 2x pufer pripremljen je unaprijed, a njegov sastav na veden je u Tablici 3. Slijed nukleotida početnica je: 5’-GGACAATGACGATCCGAGATA-3’, odnosno 5’ -CATCCCTCCCATTGCATTAT-3’. Njima je umnožen fragment DNA gena nad5-4. Smjesa za amplifikaciju pripremljena je za ukupni broj uzoraka s kojim se radilo, s time da je ukupni volumen po uzorku bio 25 µL (Tablica 4.). |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 29 <-- 29 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 Osnovni podaci o istraživanim provenijencijama ković 2003) koji su poslužili za uzorkovanje kao i pro( Uprava šuma, Šumarija) odakle je skupljano sjeme za venijenicjcje ee ko analizirane, a nema ih u pokusima, kojje ee s ssu uu anal osnivanje pokusa provenijencija (Gračan 2001, Ivan-prikazanii s ssu uu u uu tablici 1. Tablica 1. Osnovni podaci o istraživanim provenijencijama obične jele Table 1 Silver fir provenance datas Prov. prov P-1 P-2 P-3 P-4 P-5 P-6 P-7 P-8 P-9 P-10 P-11 P-12 P-13 P-14 Šumarija Forest office Našice, Voćin Požega, Kamensko Koprivnica, Ivanec Zagreb, Krapina Zagreb, Zagreb Ogulin, Josipdol Ogulin, Ogulin Delnice, Gomirje Delnice, Vrbovsko Delnice, Vrbovsko Delnice, Skrad Delnice, Skrad Delnice, Zalesina Delnice, Tršće Gosp. jedinica Management unit Djedovica -Trešnjevica 12c Zapadni Papuk II 32d Trakošćan 7d Macelj Bistranska gora 17b Alilovica 13b Josipovac 38b Potočine-Crna kosa 8b Gluhe Drage 8 Miletka 17b Rudač 2a Rudač la Belevine Rudnik 13a Prov. prov P-15 P-16 P-17 P-18 P-19 P-20 P-21 P-22 P-23 P-24 P-25 P-26 P-27 Za analizu mtDNA u ovom radu korištena je tehnika raznolikosti duljine umnoženih fragmenata. Cjelokupnu analizu mtDNA možemo podijeliti u tri glavna dijela: sakupljanje uzoraka, izolacija cjelokupne DNA i lančana reakcija polimerazom (PCR). Nakon uspješno prove Šumarija Forest office Senj, Novi Vinodolski Senj, Krasno Gospić, Otočac Split, Imotski Postojna Novo Mesto Gosp. jedinica Management unit Duliba 1 Nadžak bilo 15, 16 Rastovka 11 Biokovo 1 Mašun Crmošnjica, Podturen Analizirane populacije koje nisu zastupljene u pokusima provenijencija Gospić, Gospić Jadovno -Jazbine Gospić, Donji Lapac Lička Plješivica (S) Gospić, Korenica Lička Plješivica (S) Plitvička jezera Medveđak – Plitvički klanac Delnice, Fužine Brloško Gospić, Gračac Lička Plješivica (J) Gospić, Gračac Velebit dene lančane reakcije polimerazom dobiveni fragmenti razdvojeni su elektroforezom. Haplotipovi su određeni na osnovi razlike u veličini fragmenta, a svi navedeni postupci obavljeni su u Laboratoriju za molekularnu genetiku Šumarskog instituta, Jastrebarsko. Prikupljanje uzoraka – Sample colection Za kvalitetnu ekstrakciju DNA potreban je svjež materijal, budući da stanica sadržava brojne enzime koji se oslobađaju njezinim raspadanjem i razgrađuju DNA. Iz tog razloga materijal za analizu mtDNA većinom je sabran s pokusa provenijencija osnovanog u rasadniku Instituta, koji je zbog blizine laboratoriju najpogodniji. Provenijencije koje zbog nedostatka sadnica nisu bile zastupljene u pokusu A-polje, uzete su iz pokusa Brloško. Kako pokus provenijencija ne pokriva cjelokupni areal obične jele u Hrvatskoj, uzorkovanje provenijencija koje nisu zastupljene ni na jednom od pokusa obavljeno je u prirodnim populacijama na području četiri Šumarije Uprave šuma Podružnica Gospić i s područja NP Plitvička jezera. Od vremena sabiranja uzoraka do ekstrakcije DNA iz prirodnih populacija grane u dužini od 50 do 60 cm stavljene su u staklenke s vodom. Jedinke s kojih su uzeti uzorci obilježene su u pokusima i u prirodnim sastojinama. Udaljenost između stabala u sastojinama bila je najmanje 100 m, a od svake provenijencije skupljeno je po šest jedinki. Područje Šumarija Donji Lapac i Korenica predstavlja provenijenciju sjevernog dijela Ličke Plješivice te su sa svakog područja uzeta po tri uzorka. Uzorci iz šumskih sastojina analizirani su naknadno zajedno s nova tri uzorka provenijencije Macelj. Ukupno je analizirano 136 stabala obične jele, 126 iz Hrvatske i 10 iz Slovenije. Izolacija stanične deoksiribonukleinske kiseline Izolation of deoxyribonucleic acid (DNA) Ukupna stanična DNA ekstrahirana je iz iglica proljetnih izbojaka obične jele. Upotrijebljeno je 5–7 iglica po stablu, ovisno o njihovoj veličini. Iglice su stavljene u plastične epruvete od 2 ml i smrznute tekućim dušikom te zdrobljene pomoću sterilnih plastičnih štapića. Dobivenom prahu dodan je 1 ml ekstrakcijskog pufera (Tablica 2.). DNA molekule izolirane su protokolom prema Doyleu i Doyleu (1987). Dobivena otopina inkubirana je 60 minuta na 55 °C u inkubatoru uz povremeno protresanje. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu dodano je 400 ml diklormetana. Otopina je pažljivo izmiješana okretanjem epruvete, jer se u slučaju prejakog miješanja otopina nije mogla razdvojiti na faze. |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 28 <-- 28 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 više vrsta kritosjemenjača i mtDNA i cpDNA nasljeđuju se po majčinskoj liniji (D u m o l in -L ap egu e i sur. 1998 prema Reboudu i Zeylu 1994). S druge strane, kod golosjemenjača se kloroplasti prije oplodnje u jajnoj stanici raspadaju (S a la j i sur. 1998) te se nasljeđuju po muškoj liniji, a mitohondriji isključivo po ženskoj liniji (Wagneru 1994 prema Liepelt i sur. 2002). Iz navedenog je razvidno kako se mtDNA i cpDNA nasljeđuju “klonski”, tj. uniparentalno bez rekombina cije među genomima roditelja. Genomi oba organela haploidni su i njihove genotipove nazivamo haplotipom. Jedine promjene u DNA bilo da je riječ o mtDNA ne pili cpDNA s ssu uu mutacije. Stoga se DNA tih dvaju staničnih organela pokazala vrlo pogodnom za populacijskogenetička istraživanja. Ti organeli omogućuju praćenje širenja pojedinih vrsta golosjemenjača biparentalno: prema kloroplastnoj DNA po muškoj liniji, a mitohondrijskoj DNA po ženskoj roditeljskoj liniji. Molekularno genetičke metode istraživanja Molecular-genetic research methods Danas u svijetu postoje vrlo pouzdane molekularno- genetičke metode kojima se rješavaju praktični problemi šumarstva vezani uz procjenjivanje genetske raznolikosti, oplemenjivanje ili zaštitu šumskih genetskih resursa (Franjić i Liber 2001). Unatoč tomu, u hrvatskom šumarstvu istraživanja ovim metodama su u samim počecima. Krajem dvadesetog stoljeća, otkrićem i razvojem tehnike PCR-a (Polymerase Chain Reaction – lančana reakcija polimerazom), dolazi do unapređenja postojećih molekularno-bioloških tehnika kao i otkrića novih. Nadalje, osim istraživanja jezgrine DNK započinje se s istraživanjima kloroplastne i mitohondrijske DNK. Mogućnosti spontane hibridizacije kavkaske i obične jele Spontaneous hybridisation possiblilities of Nordmann and Silver fir Kavkaska jela (Abies nordmanniana /Steven/ Spach) prirodno je rasprostranjena u planinama zapadnoga Slika 1. Shematski prikaz križanja između osam vrsta roda Abies (preuzeto od KORMUTAK 1997) Figure 1 Shematic representation of hybridization between eight Abies species (from KORMUTAK 1997) Kavkaza i na Pontskom gorju sjeveroistočne Turske. Raste na nadmorskoj visini (najčešće) od 800–1200 m, a nalazimo je i na nižim (600 m) i višim (2200 m) predjelima. Tvori čiste ili mješovite sastojine s vrstama Picea orientalis, Fagus orientalis i Pinus sylvestris. Važno je napomenuti da ju je u zapadnu Europu prvi puta unio botaničar Nordmann 1838. godine. Otpornija je na sušu od obične jele. Vrlo je dekorativna vrsta te se zbog habitusa, lijepe piramidalne krošnje u koje se grane spuštaju do zemlje, mnogo sadi po parkovima i nasadima (Vidaković 1993). Na Slici 1. shematski su prikazane mogućnosti križanja osam vrsta roda Abies. Vidljivo je koje se vrste križaju među sobom recipročno, koje samo u jednom smjeru te između kojih vrsta jela križanje nije moguće. Križanja pojedinih vrsta unutar roda Abies moguća su i spontano se mogu odvijati u prirodi (Kormutak 1997). Obična jela uspješno je križana i s vrstama A. veitchii, A. concolor, A. amabilis, A. numidica, A. pin- sapo i A. homolepsis. Također, prema Loftingu u Danskoj su nastali spontani križanci između obične i kavkaske jele, a pojedini su pokazali posebno dobar rast (Vidaković i Franjić 2004). Križanja vrsta unutar roda Abies istraživali su K o r mutak(1997), Kormutaki Vookova(2001), Vo okova i Kormutak (2003). i MATERIJAL I METODE – Materials and methods Osnovni podaci o provenijencijama – Basic provenance datta aa Uzorci za analizu mtDNK sakupljeni su većinom u tuta “A-polje». Manji dio uzorkovan je u prirodnim pokusima provenijencija obične jele, osnovanih na populacijama obične jele. području Šumarije Fužine “Brloško» i rasadniku Insti |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 27 <-- 27 --> PDF |
IZVORNI ZNANSTVENI ČLANCI ORIGINAL SCIENTIFIC PAPERS Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 UDK 630* 165 (001) MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) U ŠUME OBIČNE JELE (Abies alba Mill.) MACELJA I TRAKOŠĆANA POSIBILITY OF GENETICAL INTROGRESION OF NORDMANN FIR (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) IN COMMON FIR FORESTS (Abies alba Mill.) OF MACELJ AND TRAKOŠĆAN Mladen IVANKOVIĆ* SAŽETAK: U radu su prikazani rezultati molekularnih istraživanja varijabilnosti obične jele. Upotrebom PCR-a analizirana je mitohondrijska DNA (mtDNA), fragment DNA gena nad5-4. Istraživanja su provedena na biljkama iz 25 hrvatskih provenijencija i dvije slovenske provenijencije obične jele. Provedenim istraživanjem pronađena su dva haplotipa obične jele, apeninski i balkanski. Kod biljaka iz provenijencija Macelj i Trakošćan pronađeni su haplotipovi kavkaske jele, koja je najvjerovatnije unesena sadnjom sadnica, te je slobodnim križanjem s običnom jelom došlo do daljnje introgresije gena kavkaske jele u tamošnje populacije. K l j u č n e r i j e č i : obična jela, kavkaska jela, mtDNA, introgresija UVOD – Introduction Obična jela je uz hrastove i običnu bukvu temeljna, ne jele u Europi rađena u sklopu projekta Europske klimatogena vrsta drveća u Hrvatskoj (Matić 2001). unije (FOSSILVA), kao i neka druga, ukazuju na mije- Uz hrast lužnjak spada u najznačajnije šumske vrste na-šanje balkanskih i apeninskih haplotipova upravo na ših šuma. U drvnoj zalihi sudjeluje s 9,4 %, a ostale vrste području areala obične jele u Hrvatskoj (L i e p el t i dr. crnogorice (smreka, alepski bor, crni bor, obični bor, pri2002, Ballian i Kajba 2005) posebice u području morski bor, ariš, duglazija i dr.) s 5,2 % (Pr p i ć 2001). Gorskog kotara. Istraživanja genetske raznolikosti molekularno-bio-Cilj istraživanja je analizom mtDNA obične jele loškim i biokemijskim metodama (cpDNA – kloro-utvrditi genetsku varijabilnost obične jele na području plastna deoksiribonukleinska kiselina, mtDNA – mito-prirodne rasprostranjenosti u Hrvatskoj i dijelu Slovehondrijska deoksiribonukleinska kiselina, izoenzimi) nije. Ovakva su istraživanja korisna za sve poslove veprovenijencija obične jele kod nas nisu do sada rađena. zane za oplemenjivanje i uzgoj obične jele te očuvanje Međutim, rezultati istraživanja cpDNA i mtDNA obič-njenog genofonda metodama in situ i ex situ. Mitohondrijska DNA (mtDNA) i njezino nasljeđivanje kod biljaka Mitochondrion DNA (mtDNA) and its inheritance in plants Stanica, osnovna jedinica života, sadrži stanične or-Mitohondriji su pronađeni u gotovo svim eukariotganele koje su membranama odvojene od ostalih dijeskim stanicama. To su ovalni organeli duljine 1 do 3 µm lova stanice: jezgru, ribosome, mitohondrije, endo-i širine 1 µm (Buchanan i sur. 2001) koji maju svoj plazmatski retikulum, Golgijev aparat, lizosome, a u vlastiti genom (vlastitu DNK). Biljni mitohondriji, pobiljkama kloroplasti i vakuole. put mitohondrija svih eukariota, sadržavaju veći broj kružnih dvolančanih DNA molekula. Nasljeđivanje DNA iz organela stanica ne odvija se * Dr. sc. Mladen Ivanković, Odjel za oplemenjivanje i šumsko sjemenarstvo, Šumarski institut, Jastrebarsko kod svih biljaka i organela jednako. Na primjer, kod naj |