DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 56 <-- 56 --> PDF |
D. Ballian: VARIJABILNOST MIKROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE , Šumarski list br. 11-12, CXXVII1 (2004), 649-654 MATERIJAL I METODA RADA Tijekom 1999. godine sakupljeno je sjeme divlje trešnje iz tri populacije na području središnje Bosne. Populacije se nalaze u različitim ekološkim nišama, a udaljene su jedna od druge 30 km. Sjeme je sakupljeno sa 69 stabala (populacija Mrkoviči 31 stablo, Ilijaš 15, Kakanj 23), a za kontrolu je korišteno sjeme ubrano s jednog stabla domaće trešnje, poznate autohtone sorte "Alica". Inače, ova je sorta najviše zastupljena u voćnjacima gornjeg i srednjeg toka rijeke Bosne, gdje je i sabiran materijal za istraživanje. Fenologija cvjetanja kultivara poklapa se sa cvjetanjem divlje trešnje, kao i vrijeme sazrijevanja plodova. Za ekstrakciju DNK korišten je embrij koji je izvađena iz sjemena mehaničkim putem. Njegova veličina i masa zavisila je od veličine sjemena, a masa se kretala oko 0,0005 g kod divlje trešnje, do 0,0008 g kod domaće trešnje. Za proučavanje unutarpopulacijske varijabilnosti slučajnim izborom uzeta su tri stabla iz populacije Mr Izolacija genomske DNK Izolacija je izvršena za genomsku (cjelokupnu staničnu) DNK (Rogers 1997). Mala veličina embriona otežavala je ekstrakciju, ali je metoda uspješno prilagođena količini embriona u prvim etapama izolacije na način kako slijedi. Embrioni su držani u tubama na temperaturi od -70 °C, najmanje 24 sata. Po njihovom vađenju iz frižidera, odmah je vršena maceracija specijalno konstru PCR-procedura i elektroforetska analiza Korištene su početnice sa 18-22 baze, proizvođača "Genosys biotechnologies - Cambridge (UK)" (Tab. 1.). Unatoč različitim temperaturama nalijeganja (TA) koviči, sa po osam sjemenki (ukupno 24 ekstrakcije), dva stabla iz populacije Ilijaš (16 ekstrakcija) i dva stabla iz populacije Kakanj (16 ekstrakcija). Također je rađena ekstrakcija i za domaću trešnju sorte "Alica" koja je služila kao kontrola, jer je najčešća u području istraživanih populacija (osam ekstrakcija). Za istraživanje međupopulacijske varijabilnosti slučajnim je izborom uzet po jedan embrion od svakog stabla, na kojem je izvršena ekstrakcija (70 ekstrakcija). Po završenoj ekstrakciji za preparate je primijenjena standardna je PCR procedura, a potom analiza na gelu. Varijabilnost između stabala i populacija procijenjena je uz primjenu X2-testa, testiranjem dobivenih distribucija u populacijama. Primjenom Hardy-Wainbergovog zakona izračunat je broj heterozigota u populacijama za sve tri populacije. iranom alatkom, uz dodavanje 2 x CTAB buffera (2 % CTAB, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl) u prilagođenoj količini od 50 ul, što se pokazalo sasvim dovoljnim za veličinu embriona. Sva daljnja procedura odvijala se uz manje preinake Rogersovo g (1997) protokola, prema količini materijala koji je služio za ekstrakciju. Modifikacija je rezultirala dovoljnom količinom DNK na kraju procesa izolacije genomske DNK. u istraživanju je za sve početnice uspješno korištena TA = 58°C. Tablica 1. Osnovni podaci o parovima početnica (Genosys biotechnologies - Cambridge). Table 1 Redni broj No. 1 2 3 4 Basic details of the primers (Genosys biotechnologies -Cambridge). Početnice Primers UDP96-003F UDP96-003R UDP96-018F UDP96-018R UDP97-402F UDP97-402R UDP98-407F UDP98-407R Broj baza Sekvenca (5´-3´) No. of bases Sequence (5´-3´) 20 TTGCTCAAAAGTGTCGTTGC 20 ACACGTAGTGCAACACTGGC 20 TTCTAATCTGGGCTATGGCG 22 GAAGTTCACATTTACGACAGGG 22 TCCCATAACCAAAAAAAACACC 20 TGGAGAAGGGTGGGTACTTG 20 AGCGGCAGGCTAAATATCAA 19 AATCGCCGATCAAAGCAAC TA*=4(#GiC) + 2(#AiT) Temperatura topljenja Melting temperature (Tm) 63,9 63,9 63,8 62,2 63,3 63,8 63,4 65,0 Temperatura nalijeganja Annealing temperature (TA)* 58 62 60 64 60 62 58 56 (#G i C) -ukupan broj baza G i C koje se nalaze u početnici (#A i T) -ukupan broj baza A i T koje se nalaze u početnici |