DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 20 <-- 20 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) ... Šumarski list br. 7-8, CXXVII (2003). 347-357 Lančana reakcija polimerazom napravljena je na Tablica 3. Sastav otopine za odvijanje lančane reakcije poli mnlnimi f,PMP Amn´PPP Quctpm Q7flfl 11-7 knrič- mpraznm famnlifikaciia^ termokrugu GENE AmpR-PCR System 9700, uz koriš tenje sljedećih temperatura: početna od 94 °C u trajanju 5 min; slijedi 25 krugova (94 °C za 1 min, 55 °C za 1 min, 72 °C za 1 min), i završne temperature od 72 °C u trajanju 8 min. Poslije lančane reakcije polimerazom u termokrugu je temperatura čekanja 4 °C (tablica 4). Nakon završene lančane reakcije polimerazom, kontrola uspješnosti provedena je elektroforezom na agar- nom gelu (Ultra pure grade agarose - Gibco BRL), uz bojenje ethidiumbromidom. merazom (amplifikacija) Master-Mix za jednu analizu Tvar Količina H20 (sterilna) 11,6 ul (9,1) 10 x Puffer 2,5 (il dNTP´s 0,4 ul MgCl2 2,0ul Primer 1 2,0 ul Primer 2 2,0 ul " Taq (disolucija) 2,0 ul Otopina DNA 2,5 ul(5) Ukupno 25 ul Tablica 4. Trajanje koraka amplifikacije za ispitivanje sekvenca Vrsta temperature Temperatura Vrijeme Broj krugova početna temperatura 94 °C 5 min temperatura denaturacije 94 °C 1 min 25 temperatura hibridizacije 55 °C 1 min 25 temperatura elongacija 72 °C 1 min 25 završna temperatura 72 °C 8 min temperatura čekanja 4°C - 2.6. Elektroforeza na poliakrilamidnom gelu - Electrophoresis on polyacrylamidic gel Poslije uspješno završene lančane reakcije polimerazom priprema se smjesa za digestiju prema recepturi iz tablice 5, a obično se radi za 36 uzoraka po jednom krugu rada sekvencera. Zatim se provodi digestija, tako da se pripravak 3 do 5 min grije u termokrugu GENE AmpR-PCR System 9700 na 95 °C. Tada se uzorci brzo izvade i stave u led do postavljanja uzoraka na poliakrilamidni gel, da ne bi došlo do njihove ponovne hibridizacije.. Tablica 5. Priprava smjese za digestiju na sekvenceru Tvar Količina Količina Vanjski mjerač mjerač 50 lul - lul mjerač 100 - lul lul mjerač 150 - - 1^1 mjerač 196 lul lul lul produkt amplifikacije P 30141 lul - - produkt amplifikacije P 30249 lul — - produkt amplifikacije P 71936 - 2ul - loading dye 6ul 6ul 6ul ukupno lOul lOul lOul Poliakrilamidni gel pripravljen je na temelju gotovih preparata koji se neposredno prije postavljanja gela izmiješaju i utisnu u odgovarajuću šablonu za gel, koja se rabi na sekvenceru Pharmacia LKB-A.L.F. "Alf express DNA Sequencer". Rad sekvencera traje je oko 65 do 70 minuta. 2.7. Očitavanje gelova i statistička obrada podataka Reading of gels and statistical data analysis Sekvencer je povezan s mikroprocesorom u kojemu je instaliran program FRAGMENT MANAGER version 1.1 (Pharmacia) podešen za mjerenje amplifici- ranih fragmenata. Vrijednosti se očitavaju automatski, uz prethodno poravnanje uz pomoć vanjskih mjerača. Kao krajnji produkt dobije se florogram s veličinama određenih fragmenata. Pošto se završi sekvencionira- nje svih uzoraka radi se cross-check, na osnovu kojih se provode 4 korekcije dobivenih vrijednosti. Te nove, korigirane vrijednosti unose se u računalni program 350 |