DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 19 <-- 19 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) Šumarski list br. 7-8, CXXVII (2003). 347-357 2.2. Izbor stabala Choice of trees Za analizu cpDNA uzimao se jednaki broj biljaka u uzorak populacije, tako da populaciju predstavlja 24 stabla. Inače se pri prikupljanju uzoraka za tu analizu vodilo računa da uzorci budu sabrani sa stabala među sobno udaljenih najmanje 100 m. Zbog loših vremenskih prilika u vrijeme sabiranja uzoraka, manji je broj jedinki u populaciji Biokova i Gorskog kotara A i J (tablica 1). Tablica 1. Istraživane populacije obične jele u Bosni i Hercegovini i Hrvatskoj Broj Populacija Zemljopisna širina Zemljopisna dužina Broj uspješnih analiza cpDNA 1 Meka brda (Kalinovik) 18° 35´ 43° 29´ 24 2 Vranića (Fojnica) 17° 54´ 43° 56´ 24 3 Gorski kotar A adultna (Delnice) 14° 50´ 45° 25´ 21 4 Gorski kotar Jjuvenilna (Delnice) 14° 50´ 45° 25 22 5 Biokovo (Makarska) 17° 08´ 43° 08´ 18 6 Crni vrh (Tešanj) 18° 00´ 44° 34´ 24 7 Orjen (Trebinje) 18"33´ 42" 38´ 24 8 Cabulja (Posušje) 17° 35´ 43°32´ 24 Ukupno 181 2.3. Način skupljanja uzoraka - Method of sample collection S obzirom na to da je cpDNA analiza oslobođena učinka dominacije i fenotipskih interakcija (Borojevi ć, 1985), pri sabiranju uzoraka pazilo se da se uzmu samo živi dijelovi biljke. Za analizu cpDNA iskorištene su jednogodišnje iglice. Sa stabala s kojih je grančicu bilo teško skinuti sa zemlje moralo se provesti otpucavanje iz gornjeg dijela, jer je to bilo najbrže i najjednostavnije. 2.4. Metoda izolacije ukupne DNK - Method of total DNA isolation DNA je izolirana iz djelića jednogodišnje svježe iglice, težine 50 mg. Uporabljen je laboratorijski komplet za izolaciju ukupne DNA i procedura propisana uz njega (DNeasy Plant Mini Kit, DNeasy 96 Plant Protocol for Izolation of DNA feom Plant Leaf Tissue od QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). Protokol je sličan onome koji predlaže Rogers (1997). Uspješnost izolacije DNK kontrolirala se aparatom za mjerenje koncentracije DNA "Hoefer" - DvNA Quant 200 flurometer. 2.5. Lančana reakcija polimerazom (PCR) - Chain reaction by polymerase (PCR) Iskorišteni su primeri sa 21 do 22 baze, dani u tablici 2. Tablica 2. Parovi primera iskorišteni u procesu amplifikacije Redni broj Šifra Primeri Lokus Broj baza Sekvenca(3´-5´) Temperatura topljenja (Tm) Temperatura nalijeganja (TA)* 1 P30141 F 22 TTTTATGTCAGCAACAGAAGCC 50 62 P30141 R 22 GGGAACATAGAGATCAAATTAC 50 60 2 P30249 F 22 GTAATTTGATCTCTATGTTCCC 50 60 P30249R 22 AATCAACTGGTTCGGATTGATC 50 62 3 P71936F 22 CCCGATCACATAAAGGTTACTT 58; 1 62 P71936R 21 CCCTTAGAGTACATGCCAAAA 57,9 60 TA*= 4(#GiC) + 2(#AiT); (#G i C) - broj baza G i C u primeru (#A i T) - broj baza A i T u primeru Za lančanu reakciju polimerazom rađen je reakcij- ski volumen od 25 pl za par primera, a sve potrebno za jednu analizu prikazano je u tablici 3. Kompletna priprava za lančanu reakciju polimerazom napravljena je na robotnoj radnoj stanici Biomek 2000 (Beckman Instruments). Unatoč različitim temperaturama hib- ridizacije (TA) u pokusu je za sve primere uspješno je primijenjena temperatura TA = 55 °C. 349 |