DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 17 <-- 17 --> PDF |
IZVORNI ZNANSTVENI ČLANCI - ORIGINAL SCIENTIFIC PAPERS Šumarski list br. 7-8, CXXVII (2003), 347-357 UDK 630* 165 (001) PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) ANALIZOM cpDNA U DIJELU PRIRODNIH POPULACIJA BOSNE I HERCEGOVINE I HRVATSKE* ASSESSMENT OF GENETIC VARIABILITY OF SILVER FIR (Abies alba Mill.) WITH CP DNA ANALYSIS IN THE PART OF NATURAL POPULATIONS OF BOSNIA AND HERZEGOVINA AND CROATIA Dalibor BALLIAN1 SAŽETAK: U ovom istraživanju utvrđivanaje molekularnogenetička varijabilnosti nekih populacija obične jele u Hrvatskoj i Bosni i Hercegovini (Vranića, Meka brda, Gorski kotar - adultna, Gorski kotar - juvenilna, Crni vrh, Cabulja, Orjen). Varijabilnost se istraživala na molekularnoj razini, uz pomoć analize kloroplastne DNA (cpDNA). Ovo je istraživanje značajno za dalje radove na oplemenjivanju obične jele, odnosno u procesu obnove jelovih šuma (pošumljivanje i sjetva sjemena), te za osnivanje banaka i arhiva gena metodama in situ i ex situ. Pomoću analize kloroplastne DNA, točnije broja haplotipova (H), efektivnog broja haplotipova (Ne), haplotipske raznolikosti (Hexp i Sw), vidljivo je da su prisutne razlike između istraživanih populacija, a napose između malih izoliranih i velikih populacija. Ključne riječi: Abies alba Mili., varijabilnost, CpDNA 1. UVOD - Obična je jela {Abies alba Mili.) jedna od najznačajnijih vrsta šumskog drveća s gospodarskog i ekološkog stajališta u Hrvatskoj i Bosni i Hercegovini, a i u više srednjoeuropskih zemalja. U Hrvatskoj je zastupljena na 200 000 ha (Vukelić i Baričević, 2001), a u Bosni i Hercegovini na 562 237 ha (U š ć u p 1 i ć, 1992) ili u oko 50 % svih visokih šuma. U novije vrijeme zagađivanje atmosfere i pedosfere glavni je razlog propadanja jelovih šuma. O obnovi jelovih šuma nije se dovoljno vodilo računa, jer je manipulacija sjemenom prilično otežana i skupa, kao i proizvodnja sadnog materijala jele. Ipak u posljednje se vrijeme ulažu veliki napori za očuvanje genofonda * Doktorska disertacija obranjena na Šumarskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu, članovi povjerenstva - doc. dr. se. Davorin Kajba, prof. dr. se. Rifat Hadžiselimović i doc. dr. se. Josip Franjić (skraćeno cpDNA istraživanje za Šumarski list) 1 Dalibor Ballian, Šumarski fakultet u Sarajevu, Zagrebačka 20, 71 000 Sarajevo, BiH Introduction obične jele, kako bi se ona očuvala od potpunog nestajanja za buduće generacije. Cilj ovog istraživanja je utvrđivanje molekularno- genetičke varijabilnosti nekih populacija obične jele u Hrvatskoj i Bosni i Hercegovini. Osim velikih populacija kao što su one Gorskog kotara, Vraniće i Mekih brda, težište istraživanja bilo je i na malim populacijama iz submediteranskog područja (Biokova i Orjena), kako bi se ustanovilo kakva je njihova veza s populacijama iz središnjeg dijela prirodnog rasprostiranja u Bosni i Hercegovini i Hrvatskoj, a također jedne uvjetno rečeno panonske populacije (Crni vrh). Uz to utvrdila bi se razlika između adultne propadaj uće populacije obične jele iz Gorskog kotara i njezine juvenilne generacije koja pokazuje vitalnost. Varijabilnost se istraživala na molekularnoj razini, uz pomoć analize kloroplastne DNA. Krajnja je svrha istraživanja utvrditi postoji li značajna varijabilnost između populacija, što bi bilo važ- 347 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 18 <-- 18 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) Šumarski list br. 7-8. CXXV11 (2003). 347-357 no za gospodarenje u šumama obične jele i u uzgojnim vih šuma (pošumljivanje i sjetva sjemena), te za osniva- radovima. nje banaka i arhiva gena metodama in situ i ex situ. Ovo je istraživanje značajno za dalje radove na oplemenjivanju obične jele, odnosno u procesu obnovejelo- 1.1. Klor« plast na DNA i njezino značenje u populacijskoj genetici Chloroplast DNA and its importance in population genetics Za razliku od jezgrine DNA, kloroplastna DNA ne podliježe procesima rekombinacije, te joj to svojstvo daje veliko ulogu u istraživanjima postglacijalnih seoba šumskog drveća (Slatkin 1994). Kloroplasti su cito- plazmatske organele koje se nasljeduju od jednog roditelja, a u rodu Abies, prema S a 1 aj u i sur. (1998) nasljeduju se od oca, zbog destrukcije majčinskih kloroplasta. Ziegenhagen i sur. (1996) zbog nepoznavanja te problematike dobili su slabe rezultate u istraživanju haplotipova kod makrogametofita, a za polen su dobili dobre rezultate. Zbog nasljeđivanja od jednog roditelja cpDNA se pokazala pogodnom za populacijskogenetič- ka istraživanja, napose na razini rodova (genus) i pod- rodova (subgenus) te pri varijabilnosti unutar vrste (Bachmann, 1994). Ipak, ta metoda za sada pokazuje ograničene mogućnosti u ekološkim istraživanjima. Tako u jela možemo razdvojiti dvije faze pokretnosti gena. Prva ili gametofitna faza je i najpokretljivija, jer se polen (muška gameta) prenosi vjetrom na velike udaljenosti, do 35 km (60 km). Geni muškog roditelja brzo se prenose s jednog mjesta na drugo mjesto i odlučujući su za genetički tijek. Druga faza ili faza sporofita manje je pokretljiva, iako je sjemenka opskrbljena sjemenim krilcem koje omogućuje bolje raznošenje. Ipak sjemenka jele razmjerno je teža od sjemena drugih četinjača, pa se za razliku od njih raznosi na manje udaljenosti, a pri jenos na veće udaljenosti povezan je sa zoohorijom ili hidrohorijom. Prema podacima koje navode Huntley i B irks (1983) brzina kretanja obične jele, dobivena na osnovi analiza polena, iznosila je od 40 od 300 m godišnje, ovisno o razdoblju, tako daje najbrže kretanje bilo prije 6 000 godina. Vidljivo je da kloroplastni genom, koji je podrijetlom od muškog roditelja, ima mogućnost brzog širenja unutar populacije i između populacija, a ženski je vezan za jezgru i ima manju mogućnost širenja. Jezgrina DNA je pod snažnim utjecajem polena (DNA muškoga genoma), podložna mejotičnim diobama i krosingoveru, što dovodi do velike raznolikosti u potomstvu. Takvih utjecaja nema kod kloroplastnoga genoma, te se on pokazuje pogodnim za populacijsko- genetičke studije šumskih vrsta drveća. Autori do sada objavljenih radova s cpDNA analizirali su većinom intergenetičke sekvence te proučavali varijabilnost haplotipova i polimorfizam kloroplastnih mikrosatelita (SSRs) u nekih vrsta šumskog drveća: jele (Ziegenhagen i sur. 1995; Vendramin i Ziegenhagen, 1997;Vendramin i sur, 1999;Liepelt i sur., 2001), smreke (Scott i i sur., 1998; Vendramin i sur, 2000), crvenih borova (Echt i sur., 1998), primorskog bora (Vendramin i sur., 1998), pitomog kestena (Fine s c h i i sur, 2000), hrasta (S1 a d e, 2001). 2. MATERIJAL I METODE RADA - Material and working methods 2.1. Izbor i opis terenskih objekata - Choice and description of field sites Tijekom studenoga 2000. godine selekcionirana su stabla obične jele na području Hrvatske, u Gorskom kotaru (Šumarija Vrbovsko, Skrad, Fužine, Gerovo) i na Biokovu, te u Bosni i Hercegovini, na području Vraniće, Čabulje, Orjena, Mekih brda i Crnog vrha (tablica 1 i karta 1). Pri odabiru populacija vodilo se računa da se odaberu podjednako velike i sa znanstvenog stajališta zanimljive male populacije. Vodilo se računa i o tome da populacije budu iz kontrastnih ekoloških uvjeta i da, po mogućnosti, pripadaju različitim fito- cenozama i geološkim podlogama. Od populacija Gorskog kotara, za jednu populaciju izabrana su adult- na stabla koja su u fazi sušenja, za drugu populaciju uzeta su mlada stabla i pomladak, odnosno juvenilni stadij koji pokazuje vitalnost, a biljke koje su uzete u uzorak rastu u neposrednoj blizini adultnih stabala prve populacije. Slovenija C^ /Gorski kotar J ^ ^^"^ Gorski kotar A I Bosna i Hercegovina \—4>~- \ — Crni vrh / \ \ "^ ČaVlJa Vranića y_ ^> Meka brda \ Biokovo *=^ /* ´"^V^ Orjen Karta 1. Raspored istraživanih populacija 348 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 19 <-- 19 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) Šumarski list br. 7-8, CXXVII (2003). 347-357 2.2. Izbor stabala Choice of trees Za analizu cpDNA uzimao se jednaki broj biljaka u uzorak populacije, tako da populaciju predstavlja 24 stabla. Inače se pri prikupljanju uzoraka za tu analizu vodilo računa da uzorci budu sabrani sa stabala među sobno udaljenih najmanje 100 m. Zbog loših vremenskih prilika u vrijeme sabiranja uzoraka, manji je broj jedinki u populaciji Biokova i Gorskog kotara A i J (tablica 1). Tablica 1. Istraživane populacije obične jele u Bosni i Hercegovini i Hrvatskoj Broj Populacija Zemljopisna širina Zemljopisna dužina Broj uspješnih analiza cpDNA 1 Meka brda (Kalinovik) 18° 35´ 43° 29´ 24 2 Vranića (Fojnica) 17° 54´ 43° 56´ 24 3 Gorski kotar A adultna (Delnice) 14° 50´ 45° 25´ 21 4 Gorski kotar Jjuvenilna (Delnice) 14° 50´ 45° 25 22 5 Biokovo (Makarska) 17° 08´ 43° 08´ 18 6 Crni vrh (Tešanj) 18° 00´ 44° 34´ 24 7 Orjen (Trebinje) 18"33´ 42" 38´ 24 8 Cabulja (Posušje) 17° 35´ 43°32´ 24 Ukupno 181 2.3. Način skupljanja uzoraka - Method of sample collection S obzirom na to da je cpDNA analiza oslobođena učinka dominacije i fenotipskih interakcija (Borojevi ć, 1985), pri sabiranju uzoraka pazilo se da se uzmu samo živi dijelovi biljke. Za analizu cpDNA iskorištene su jednogodišnje iglice. Sa stabala s kojih je grančicu bilo teško skinuti sa zemlje moralo se provesti otpucavanje iz gornjeg dijela, jer je to bilo najbrže i najjednostavnije. 2.4. Metoda izolacije ukupne DNK - Method of total DNA isolation DNA je izolirana iz djelića jednogodišnje svježe iglice, težine 50 mg. Uporabljen je laboratorijski komplet za izolaciju ukupne DNA i procedura propisana uz njega (DNeasy Plant Mini Kit, DNeasy 96 Plant Protocol for Izolation of DNA feom Plant Leaf Tissue od QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). Protokol je sličan onome koji predlaže Rogers (1997). Uspješnost izolacije DNK kontrolirala se aparatom za mjerenje koncentracije DNA "Hoefer" - DvNA Quant 200 flurometer. 2.5. Lančana reakcija polimerazom (PCR) - Chain reaction by polymerase (PCR) Iskorišteni su primeri sa 21 do 22 baze, dani u tablici 2. Tablica 2. Parovi primera iskorišteni u procesu amplifikacije Redni broj Šifra Primeri Lokus Broj baza Sekvenca(3´-5´) Temperatura topljenja (Tm) Temperatura nalijeganja (TA)* 1 P30141 F 22 TTTTATGTCAGCAACAGAAGCC 50 62 P30141 R 22 GGGAACATAGAGATCAAATTAC 50 60 2 P30249 F 22 GTAATTTGATCTCTATGTTCCC 50 60 P30249R 22 AATCAACTGGTTCGGATTGATC 50 62 3 P71936F 22 CCCGATCACATAAAGGTTACTT 58; 1 62 P71936R 21 CCCTTAGAGTACATGCCAAAA 57,9 60 TA*= 4(#GiC) + 2(#AiT); (#G i C) - broj baza G i C u primeru (#A i T) - broj baza A i T u primeru Za lančanu reakciju polimerazom rađen je reakcij- ski volumen od 25 pl za par primera, a sve potrebno za jednu analizu prikazano je u tablici 3. Kompletna priprava za lančanu reakciju polimerazom napravljena je na robotnoj radnoj stanici Biomek 2000 (Beckman Instruments). Unatoč različitim temperaturama hib- ridizacije (TA) u pokusu je za sve primere uspješno je primijenjena temperatura TA = 55 °C. 349 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 20 <-- 20 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) ... Šumarski list br. 7-8, CXXVII (2003). 347-357 Lančana reakcija polimerazom napravljena je na Tablica 3. Sastav otopine za odvijanje lančane reakcije poli mnlnimi f,PMP Amn´PPP Quctpm Q7flfl 11-7 knrič- mpraznm famnlifikaciia^ termokrugu GENE AmpR-PCR System 9700, uz koriš tenje sljedećih temperatura: početna od 94 °C u trajanju 5 min; slijedi 25 krugova (94 °C za 1 min, 55 °C za 1 min, 72 °C za 1 min), i završne temperature od 72 °C u trajanju 8 min. Poslije lančane reakcije polimerazom u termokrugu je temperatura čekanja 4 °C (tablica 4). Nakon završene lančane reakcije polimerazom, kontrola uspješnosti provedena je elektroforezom na agar- nom gelu (Ultra pure grade agarose - Gibco BRL), uz bojenje ethidiumbromidom. merazom (amplifikacija) Master-Mix za jednu analizu Tvar Količina H20 (sterilna) 11,6 ul (9,1) 10 x Puffer 2,5 (il dNTP´s 0,4 ul MgCl2 2,0ul Primer 1 2,0 ul Primer 2 2,0 ul " Taq (disolucija) 2,0 ul Otopina DNA 2,5 ul(5) Ukupno 25 ul Tablica 4. Trajanje koraka amplifikacije za ispitivanje sekvenca Vrsta temperature Temperatura Vrijeme Broj krugova početna temperatura 94 °C 5 min temperatura denaturacije 94 °C 1 min 25 temperatura hibridizacije 55 °C 1 min 25 temperatura elongacija 72 °C 1 min 25 završna temperatura 72 °C 8 min temperatura čekanja 4°C - 2.6. Elektroforeza na poliakrilamidnom gelu - Electrophoresis on polyacrylamidic gel Poslije uspješno završene lančane reakcije polimerazom priprema se smjesa za digestiju prema recepturi iz tablice 5, a obično se radi za 36 uzoraka po jednom krugu rada sekvencera. Zatim se provodi digestija, tako da se pripravak 3 do 5 min grije u termokrugu GENE AmpR-PCR System 9700 na 95 °C. Tada se uzorci brzo izvade i stave u led do postavljanja uzoraka na poliakrilamidni gel, da ne bi došlo do njihove ponovne hibridizacije.. Tablica 5. Priprava smjese za digestiju na sekvenceru Tvar Količina Količina Vanjski mjerač mjerač 50 lul - lul mjerač 100 - lul lul mjerač 150 - - 1^1 mjerač 196 lul lul lul produkt amplifikacije P 30141 lul - - produkt amplifikacije P 30249 lul — - produkt amplifikacije P 71936 - 2ul - loading dye 6ul 6ul 6ul ukupno lOul lOul lOul Poliakrilamidni gel pripravljen je na temelju gotovih preparata koji se neposredno prije postavljanja gela izmiješaju i utisnu u odgovarajuću šablonu za gel, koja se rabi na sekvenceru Pharmacia LKB-A.L.F. "Alf express DNA Sequencer". Rad sekvencera traje je oko 65 do 70 minuta. 2.7. Očitavanje gelova i statistička obrada podataka Reading of gels and statistical data analysis Sekvencer je povezan s mikroprocesorom u kojemu je instaliran program FRAGMENT MANAGER version 1.1 (Pharmacia) podešen za mjerenje amplifici- ranih fragmenata. Vrijednosti se očitavaju automatski, uz prethodno poravnanje uz pomoć vanjskih mjerača. Kao krajnji produkt dobije se florogram s veličinama određenih fragmenata. Pošto se završi sekvencionira- nje svih uzoraka radi se cross-check, na osnovu kojih se provode 4 korekcije dobivenih vrijednosti. Te nove, korigirane vrijednosti unose se u računalni program 350 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 21 <-- 21 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) ... Šumarski list br. 7-8, CXXVII (2003), 347-357 Excel, a zatim se podaci konvertiraju u statistički program ARLEQUIN ver 1.1 i statistički obrade. Izračunati su sljedeći parametri: broj haplotipova (H), postotak specifičnih haplotipova (Ph), efektivni broj haplotipova (Ne), haplotipska raznolikost (Hexp), unutarpopulacijska haplotipska raznolikost (Sw), ha- perding test (HRI), srednja haplotipska diferencijacija parova (Xij), genetička distanca metodom parova, genetička distanca linearnom metodom parova, potpuna haplotipska distanca metodom parova, potpuna haplotipska distanca linearnom metodom parova, kompo- nentna analiza za ukupnu raznolikost, PCA analiza na temelju parova. 3. REZULTATI ISTRAŽIVANJA I RASPRAVA - Research results and discussion 3.1. Genetička varijabilnost haplotipova - Genetic haplotypic variation Uz pomoć triju kloroplastnih mikrosatelita (cpSSR), Pt 30141, Pt 30249 i Pt 71936, analiziranje polimorfi- zam u osam populacija iz Hrvatske i Bosne i Hercegovine. Nakon uspješno urađenog sekvencioniranja amplifi- ciranih uzoraka iz osam populacija i statističke obrade podataka, kao rezultat mikrosatelitske analize dobiveno je 116 različitih haplotipova. U tablica 6 dano je samo prvih 20 haplotipova, a njihov zemljopisni raspored prikazanje na karti broj 2, gdje svaka boja označava drugi haplotip, a frekvencije haplotipova prema ućešču boje na karti. Za lokus Pt 30141 ustanovljene su četiri varijante, za lokus Pt 30249 osamnaest, a za lokus Pt 71936 četrnaest varijanti. U svom radu Vendramin i sur. (1999) za istraživane populacije, među kojima su bile i tri iz Hrvatske, ustanovili su osam varijanti, a u ovom ih radu ima četrnaest (tablica 8). Iz toga je vidljivo da u istraživanim populacijama postoji velika polimorfnost, što su ustanovili iZiegenhagen i sur. (1995), odnosno velika genetička raznolikost, čak i u malim, izoliranim populacijama koje su se istraživale u ovom radu. Tablica 17. Prvih 20 haplotipova s markernim veličinama (bp) nađenih u istraživanim populacijama obične jele Haplotip cpSSR lokus Broj haplotipova Haplotip Pt30141 Pt 30249 Pt 71936 Broj haplotipova H01 100 147 150 7 H02 100 140 150 5 H03 100 147 152 5 H04 100 144 151 4 H05 99 142 151 4 H06 100 153 150 4 H07 99 147 157 4 1108 100 146 152 3 H09 100 143 150 3 H10 100 147 149 3 Hll 100 138 155 3 H12 100 148 155 3 H13 100 145 152 3 H14 100 147 155 3 H15 100 142 150 2 H16 100 138 152 2 H17 100 151 151 2 H18 100 147 153 2 H19 100 136 152 2 H20 99 141 153 2 Broj haplotipova (H) varirao je od populacije do populacije. Najveći broj haplotipova registriran je u populaciji Vraniće i Gorski kotar J, po 21 haplotip (tablica 7), što se i očekivalo, s obzirom na to da su to dvije velike populacije s velikim protokom gena. Najmanje je haplotipova registrirano u populaciji Biokova, samo 16 različitih haplotipova. Glede činjenice da je to mala, izolirana populacija, to se i očekivalo. Srednji je broj haplotipova za populacije 18,44, uz standardnu devijaciju od 1,8480. Rezultate koje su dobili Vendramin i sur. (1999) za tri populacije iz Hrvatske (Delnice, Našice i Požega) pokazuju da se broj haplotipova kreće od 5 do 34, s tim što je broj analiziranih uzoraka u populacijama različit. Za nas je zanimljiva 351 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 22 <-- 22 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) Šumarski list br. 7-8, CXXVII (2003), 347-357 populacija Delnica koja je bila zastupljena sa 95 uzoraka i dala je 34 haplotipa. Naš uzorak iz populacije Gorskog kotar A ima 17 haplotipova, a iz populacije Gorskog kotara J 21 haplotip, stoje ipak usporedivo s obzirom na broj analiziranih uzoraka. Parducci i Szmidt (1999) dobili su samo 5 haplotipova uz korištenje deset primera. U ovom istraživanju postotak specifičnih haplotipova iznosio je od 12,50 % u populaciji Biokova do 61,90 % u populaciji Vraniće. Srednji postotak specifičnih haplotipova iznosio je 43,81 %, sa standardnom devijacijom 3,55 (tablica 7). Za populaciju Delnica u radu Vendramina i sur. (1999) postotak specifičnih haplotipova iznosio je oko 42 %, a u ovom istraživanju populacije Gorskog kotara A i Gorskog kotara J imaju veličine 23,50% i 57,14%. U istraživanju E c h t a i sur. (1998) za Pinus resino- sa postotak specifičnih haplotipova iznosio je 60,8 %, a u radu Vendramina i sur. (1998) na Pinus pir aster 73,5 %. Bucci i sur. (1998) u istraživanju na Pinus halepensis dobili su 88,8 % specifičnih haplotipova. Tablica 7. Populac ije analizirane u istraživanju i dobiveni rezultati Populacija Broj analiziranih stabala (N) Broj haplotipova (H) Specifični haplotipovi (Ph) Efektivni broj haplotipova (Ne) Haplotipska raznolikost (Hexp) Unutarpopulacij ska varijabilnost (Sw) Meka brda 24 18 8 13,71 0,96 3,58 Vranića 24 21 13 19,20 0,98 7,25 Gorski kotar A 21 17 4 12,60 0,96 4,82 Biokovo 18 16 2 14,72 0,98 6.38 Gorski kotar J 22 21 12 20,16 0,99 9.40 Crni vrh 24 17 9 12,52 0,96 7,43 Orjen 24 20 10 16,94 0,98 8,36 Cabulja 24 17 5 13,09 0,96 8,39 sr. vrijednost 22,81 18.44 8,08 15,38 0,97 6,98 Varijanca 1,92 1,84 3,55 2,85 0,0127 1,84 Iz toga je vidljivo da obična jela u istraživanjima s ovom grupom cpSSR markera nema velik udio specifičnih haplotipova. Inače, velik udio specifičnih haplo tipova iskorišteno je kod hrastova (Slade, 2001) i za određivanje migracija hrasta i drugih listaća poslije ledenog doba. Tablica 19. Dosad objavljeni radovi i rezultati analize cpSSR lokusa u populacijama različitih vrsta porodice Pinaceae Vrsta Autor Broj analiziranih populacija Broj analiziranih cpSSR lokusa Broj varijanti Broj haplotipova Pinus halepensis Morgantc i sur. (1997) 10 12 28 37 Pinus leueodermis Ve n d r a m i n i sur. (1999) 7 10 29 48 Pinus brutia Bucci i sur. (1998) 8 9 28 40 Pinus svlvestris Provan isur.(1998) 7 17 - 174 Pinus pinaster Vendramin i sur. (1998) 10 9 24 34 Pinus retinosa Echt i sur. (1998) 7 9 25 23 Picea abies Vendramin i sur. (2000) 97 3 21 47 Abies alba Ve n d r a m i n i sur. (1999) 17 2 26 90 Abies alba U ovom istraživanju 8 3 36 116 Najmanji efektivni broj haplotipova pokazuje populacija Crnog vrha, sa 12,52, i populacija Gorskog kotara A, s veličinom 12,60. Budući daje posrijedi jedna velika i jedna mala populacija, mali efektivni broj haplotipova mogao bi se objasniti na sljedeći način: Crni vrh je mala i izolirana populacija, a populacija Gorskog kotara A velika je ali ograničena samo na stara stabla u procesu sušenja i dugo je godina bila pod velikim selekcijskim pritiskom, pa bi se i ona mogla uvjetno uzeti kao malena. Inače, populacija Gorskog kotara A već niz godina izložena je i neprestanoj selekciji koju uzrokuje čovjek određenim načinima gospodarenja, pa joj je i na taj način poremećena struktura, s obzirom na to da populacija Gorski kotar J pokazuje najveću vrijednost od 20,16 za ovo svojstvo, ali je ona predstavljena velikom populacijom mladih i vitalnih 352 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 23 <-- 23 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) Šumarski list br. 7-8, CXXV1I (2003). 347-357 biljaka. Slijedi populacija Vraniće sa 19,20, što se i očekivalo, jer je to vrlo vitalna i velika populacija. Srednji efektivni broj haplotipova za to svojstvo iznosi 15,38, sa standardnom devijacijom od 2,85 (tablica 7). U svim istraživanim populacijama dobivene su visoke vrijednosti haplotipske raznolikosti. Vrijednosti iznose od 0,96 u populacije Crnog vrha do 0,99 u populacije Gorskog kotara J. Srednja vrijednost za haplo- tipsku raznolikost istraživanih populacija iznosi 0,97 (tablica 7). Uspoređujući te rezultate sa rezultatom Vendra- mina i sur. (1999) primijećuje se da populacija iz Delnica ima visoku haplotipsku raznolikost, s vrijednosti 0,96. Populacija Požege ima vrijednost 0,95, a populacija Našica ima relativno nižu vrijednost, 0,76. Dobiveni rezultati u oba istraživanja upućuju na veliku raznolikost i bogatstvo haplotipova u istraživanim populacijama. Prema istraživanju Vendramina i sur., populacija Pireneja (Španjolska) ima vrijednost samo 0,47, a populacija planine Palatian u Njemačkoj ima vrijednost 0,66. Svojstvo unutarpopulacijske varijabilnosti s alel- nim vrijednostima (Sw) u ovom istraživanju najviše pokazuje populacija Gorskog kotara J sa 9,40, a najmanju pokazuje populacija Mekih brda sa 3,58. Srednja je vrijednost za sve populacije 6,98, sa standardnom devijacijom 1,84. Iz toga je vidljivo da populacije Gorskog kotara J, Orjena, Čabulje, Vraniće i Crnog vrha pokazuju visoku razinu unutarpopulacijske varijabilnosti (tablica 7), a populacije Mekih brda, Gorskog kotara A i Biokova pokazuju manje vrijednosti unutarpopulacijske varijabilnosti. Za populaciju Biokova taj se rezultat očekivao s obzirom na njezinu veličinu i vjerojatno veću prisustnost inbridinga. Za populaciju Mekih brda ne bismo mogli donijeti valjan zaključak, osim daje, možda, na rezultat Medupopulacijska odstupanja dobivena metodom parova (FST/GST), najveća su između populacija Mekih brda i Gorskog kotara A, a potom Mekih brda i Crnog vrha, te između populacija Crnog vrha i Gorskog kotara A. Razlog je to stoje populacija Mekih brda najudaljenija od populacije Gorskog kotara A, a uz to je populacija Gorskog kotara A bila pod velikim selekcijskim utjecajem čovjeka zbog načina gospodarenja, a u posljednje vrijeme zbog propadanja kao posljedice utjecaja zagađivača. Razlike između populacije Crnog vrha i Gorskog kotara A, odnosno Crnog vrha i Mekih brda vjerojatno su posljedica veličine i izoliranosti pripanonske populacije Crnog vrha, a koja je izrazito mala i vjerojatno utjecao izbor uzoraka za analizu. U populacije Gorskog kotara A na rezultat vjerojatno utječe neprestana selekcija, odnosno sve manji broj adultnih stabala koja čine tu populaciju. Srednja vrijednost unutarpopulacijske varijabilnosti iznosi 6,98, sa standardnom vrijednošću 1,84, a za smreku su (Vendramin i sur. 2000) dobili dosta niže vrijednosti unutarpopulacijske varijabilnosti, tako daje srednja vrijednost iznosila 0,635, sa standardnom devijacijom 0,093, a razlog je to što nisu primijenili multi- modalni pristup u analize. U istraživanjima provedenima na Pinus halepensis (Bucci i sur., 1998) također su dobivene niže vrijednosti nego u ovom istraživanju, s vrijednošću 0,484. Haperdingov test (indeks) daje visoke vrijednosti multimodamih raspodjela nađenih klasa u populacijama koje su u razvoju. Dobivene su prilično niske vrijednosti testa, što pokazuje da populacije nisu stabilne i da nisu u ekspanziji. Prema dobivenim rezultatima naj- stabilnijaje populacija Mekih brda, a najnestabilnija je populacija Čabulje. Usporedimo li rezultate ovog istraživanja s rezultatima koje su Vendramin i sur. (2000) dobili za smreku, sa srednjom vrijednosti 0,275 i sa standardnom devijacijom 0,004, vidimo da su u ovom istraživanju dobivene vrlo male vrijednosti. Najveća haplotipska diferencijacija između individua unutarpopulacije (Xij), prisutna je u populaciji Gorskog kotara J, s vrijednošću diferenciranja među jedinkama populacije 9,19, što se i očekivalo s obzirom na broj prisutnih haplotipova i na broj efektivnih haplotipova. Najmanja diferencijacija registrirana je u populacije Mekih brda, s vrijednošću diferencijacije 5,43. Vrijednost srednje diferencijacije za istraživane populacije iznosi 7,29, uz standardnu devijaciju 1,0029. opterećena genetičkim driftom, za razliku od druge dvije koje pripadaju velikoj populaciji i u kojima je neometan protok gena između susjednih populacija. Najmanja su odstupanja između populacija Vraniće i Gorskog kotara J. S obzirom na to da obje pripadaju u velikim populacijama sa slobodnim protokom gena, moglo se i očekivati da će odstupanja biti relativno mala. Medupopulacijska odstupanja ustanovljena linearnom metodom parova najveća su između populacija Crnog vrha i Mekih brda, a slijedi Gorski kotar A i Meka brda, zatim Gorski kotar A i Crni vrh. Najmanja su odstupanja između populacija Gorskog kotara J i Vraniće (tablica 21). 3.2. Medupopulacijska varijabilnost - Between population variability 353 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 24 <-- 24 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) Šumarski list br. 7-8. CXXVII (2003), 347-357 Obje prikazane metode daju sukladne rezultate, odnosno da su najveća odstupanja između populacija Mekih brda i Crnog vrha, te Mekih brda i Gorskog kotara A. Cjelokupna haplotipska (Rts) odstupanja dobivena metodom parova, najveća su između populacije Gorskog kotara A i Mekih brda, s veličinom od 0,4829 ili 48,29 %, a slijede populacije Gorskog kotara J i Mekih brda sa 0,4015 ili 40,15 %. To nam pokazuje da se razlike između analiziranih populacija mogu pripisati razlikama u haplotipovima u 48,29 % i 40,15 % slučajeva, a ostalo se pripisuje drugim čimbenicima. Najmanju razliku pokazuju populacije Crnog vrha i Orjena sa 0,0004 ili 0,04 % . Linearna cjelokupna haplotipska (Rts) odstupanja (-ln (1-Rst)), najveća su odstupanja između populacije Mekih brda i Gorskog kotara A, sa 0,6594 ili 65,94 %, a slijede populacije Mekih brda i Gorskog kotara J, sa 0,5134 ili 51,34% To nam pokazuje da se razlike između analiziranih populacija mogu pripisati razlikama u haplotipovima u 65,94 % i 51,34 % slučajeva, a ostalo drugim čimbenicima. Najmanju razliku pokazuju populacije Crnog vrha i Orjena, sa 0,0004 ili 0,04 %. Za Pinus halepensis B u c c i i sur. (1998), dobili su odstupanje između populacija od 0,212 i vrijednost haplotipskc diferencijacije od 0,308. U istraživanju Echta i sur. (1998) vrijednosti su za crveni bor {Pinus resinosa) iznosile od 0,003 do 0,076, što su relativno male vrijednosti. Kod svih metoda određivanja haplotipskih odstupanja između populacija vidljivo je da su uvijek prisutne najveće vrijednosti odstupanja između populacije Mekih brda i populacija Gorskog kotara. To se i očekivalo s obzirom na najveću zemljopisnu udaljenost između tih populacija, ali i zbog utjecaja apeninskih populacija obične jele na područje Gorskog kotara (Konnert i Bergmann 1995). Analizom molekularne varijance dobivamo ukupnu genetičku raznolikost između populacija bilo pomoću haplotipske raznolikosti (Gst), bilo pomoću distance između populacija (Fst), a za vrijednost haplotipskog odstupanja (Rst) moramo još uključiti raznolikosti između haplotipova. Vrijednost genetičke raznolikosti između istraživanih populacija određena je kao raznolikost putem haplotipskih frekvencija plus raznolikost između haplotipova. Dobivena je veličina (Rst) od 0,2979 ili 29,79 %. To je izrazito velika vrijednost s obzirom na to da vrijednost diferencijacije dobivena uz pomoć haplotipskih frekvencija (Fst) iznosi 0,0196 ili 1,96 %. Iz toga zaključujemo da je raznolikost u istraživanim populacijama uvjetovana razlikama među haplotipovima u 29,79% slučajeva, a ostalo se pripisuje drugim neobuhvaćenim čimbenicima. Usporedimo li rezultate s vrijednostima dobivenima u istraživanjima provedenima na crvenom boru (E c h t i sur., 1998) koje su iznosile 0,154 (15,4 %) za haplotip- sku raznolikost, teVendramina i sur. (2000) koji su za smreku hijerarhijskom analizom dobili vrijednost od 9,97 %, vidimo daje u našim istraživanim populacijama prisutna veća raznolikost. B u c c i i sur. (1998) u istraživanju na Pinus halepensis dobili su vrijednosti Fst = 0,308 i Rst = 0,212. Veza između haplotipova na plohi PCI ima vrijednost 83,05 %, a na plohi PC2 vrijednost 12,04 % od to- (1.0 0.4 © 0,2 0.0 b" 0,2 > c 0,6 o.s PCA za parove (1-Rst) Matrix Gorski c kotar A > Gors ci kotar J Crn i vrh Vra < nica > Orjen Bic kovo Čab ulia Mel :a brda < > 0,26 0,28 0.30 0,32 0,34 PCI (var, ace, = 83,05%) 0.36 0.38 0.40 Slika l.PCA 354 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 25 <-- 25 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alka Mili.) ... Šumarski list br. 7-8. CXXVII (2003). 347-357 talnog variranja. Grupiranjem populacija dobivenih na temelju PCA (Principal Component Analysis) (slika 1) posebno se razlike uočavaju između populacija Mekih brda i Čabulje s jedne strane, te ostalih populacija s druge strane, tako da u istraživanju imamo dvije skupine gene poola. To upućuje na prisutnu zemljopisnu diferencijaciju između tih populacija. Diferencijacija je napose jaka prema populacijama Gorskog kotara A, Gorskog kotara J, i Crnog vrha (slika 1). Ostale populacije pokazuju manju diferencijaciju. S obzirom na to da su populacije Mekih brda i Čabulje u vidu neke spone s malim i izoliranim populacijama Orjena i Biokova, te s obzirom da se populacije Čabulja i Biokovo dogledaju, razlike bi, eventualno, 1. Analizom cpDNA istraživala se haplotipska varijabilnost obične jele, a dobivene su znatne razlike u broju haplotipova između populacija. 2. Pomoću analize kloroplastne DNA, točnije broja haplotipova (H), efektivnog broja haplotipova (Ne), haplotipske raznolikosti (Hexp i Sw), vidljivo je da su prisutne razlike između istraživanih populacija, a napose između malih izoliranih i velikih populacija. 3. Između adultne i juvenilne populacije Gorskog kotara (A i J) nisu utvrđene velike razlike, tako da se trebalo tražiti u veličini uzorka, jer bi se vjerojatno s povećanjem uzorka smanjile i te razlike. Inače, pri postavljanju ovog zadatka očekivalo se da bi se populacije Orjena i Biokova mogle ponašati kao i populacije Mekih brda i Čabulje. Promatrajući sliku PCA možemo primijetiti i blagu klinalnu varijabilnost između populacija Orjena i Biokova sjedne strane i Gorskog kotara A, Gorskog kotara J, Vraniće i Crnog vrha s druge strane, što odgovara putu seobe poslije ledenog doba od juga prema sjeverozapadu. U istraživanju na smreki (Vendramin i sur., 2000) PCA je omogućila da se izdiferenciraju četiri važne skupine gene poola. - Conclusions među tim populacijama praktički ne može govoriti o razlikama, jer su njihova genetička odstupanja vrlo mala. Ipak dobiveni rezultati pokazuju da bi tu trebalo suptilnije prići istraživanjima na molekularnoj razini. 4. Radi održavanja genskog resursa trebalo bi uspostaviti što gušću mrežu banki gena in situ i ex situ, nužnih za održanje genetičke raznolikosti populacija. To znači da bi svaka ekološka niša važna za običnu jelu trebala imati svoju banku gena, s odgovara- Karta 2. Raspored od 1 do 20 haplotipa u populacijama obične jele LEGENDA: Svaka boja označava jedan haplotip, s tim što veća obojena površina pokazuje i veću frekvenciju tog haplotipa u populaciji 4. ZAKLJUČCI 355 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 26 <-- 26 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) ... Šumarski list br. 7-8, CXXV11 (2003), 347-357 jućim brojem jedinki, kako bi se očuvala ekološko- fiziološka osobnost populacija. 5. U gospodarenju prirodnim resursima i njihovoj obnovi, prednost uvijek treba dati prirodnoj obnovi, uz stalno praćenje genetičke strukture, kako bi se pravodobno mogle poduzeti mjere za održanje genetičke raznolikosti koja karakterizira svaku populaciju. 6. Buduća istraživanja treba usmjeriti na ostale populacije obične jele u Hrvatskoj i Bosni i Hercegovini, Borojević, K., 1985: Geni i populacija, Novi Sad, str. 545. Bucci,G.,M.Andzidei,A. Madaghiele,G. G. Pr Vendramin, 1998: Detection of haplotypic variation and natural hybridization in halepen- sw-complex pine species using chloroplast simple sequence repeat (SSR) markers. Molecular Ecology, 7: 1633-1643. Sc Echt, C. S., L. De Verno, M. Anzidei, G. G. Vendramin, 1998: Chloroplast microsatelli- tea reveal population genetic diversity in red pine, {Pinus retinosa Ait.), Molecular Ecology, S1 7:307-316. Fineschi, S., D. Taurchini, F. Villani, G. G. Vendramin, 2000: Chloroplast DNA polymorphism reveals little geographical structure in S1 Castanea sativa Mill. (Fagaceae) throughout southern European countries, Molecular Ecology, 9: 1495-1503. Konnert, M., F. Bergmann, 1995: The geographical distribution of genetic variation of silver fir U« (Abies alba, Pinaceae) in relation to a migration history. Plant systematics and Evolution, 196 (1-2): 19-30. Ve Liepelt, S., V. Kuhlenkamp, M. Anzidei, G. G. Vendramin, B. Ziegenhagen, 2001: Pitfalls in determining size homoplasy of micro- satellite loci. Technical note, Molecular Ecology Ve Notes (2001). Morgante, M., N. Felice, G. G. Vendramin", 1997: Analysis of hypervariable chloroplast mi- crosatellites in Pinus halepensis reveals a dramatic genetic bottleneck. In: Karp, A., Issac, P. G. Ingram, D. S. (ed.): Molecular Tools for Screening Biodiversity-Plants and Animals Chapman & Hall, London: 407-412. Parducci, L., A. E. Szmidt, 1999: PCR RFLP Ve analysis of cp DNAs in the genus Abies. Theo- te utvrditi optimalan broj jedinki u uzorku. Neprestano treba pratiti gospodarske zahvate na obnovi obične jele te ih usmjeravati na održanje genetičke raznolikosti lokalnih populacija. Uz to trebalo bi provesti čitav niz pokusa s različitim provenijencijama radi istraživanja ekološkofizioloških osobitosti obične jele. retical and Applied Genetics, Berlin, 98 (5), 802-808. Provan, J., N. Soranzo, N. J. Wilson, 1998: Gene-pool variation in Caledonian and European Scots pine (Pinus sylvestis L.) revealed by chloroplast simple-sequence repeats, Proceedings of the Royal Society of London B, 265: 1-9. Scotti, I., M. Troggio,N. Soranzo, G. G. Vendramin, G. Bucci, 1998: Anew set of PCR- based, locus-specific markers for Picea abies (L.) Karst., Molecular Ecology, 7: 783-792. Slade, D., 2001: Distribucija haplotipova hrasta lužnjaka (Quercus robur L.) u Hrvatskoj, magistarski rad, Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu, str. 87. Slatkin, M., 1994: Cladistic Analysis of DNK Sequence Dana from Subdivided Populations. In: Real, A.L. (ed.): Ecological Genetics. Princeton University Press,, Princeton, New Yersey, str. 18-34. Uščuplić, M., 1992:Uticaj sistema gazdovanja na pojavu imele (Viscum album L.), Glasnik šumarskog fakulteta u Beogradu, str. 7-18. Vendramin, G. G., B. Ziegenhagen, 1997: Characterisation and inheritance of polymorphic plastid microsatellites in Abies, Genome, 40: 857-864. Vendramin, G. G., M. Anzidei, V A. Autino, A. Madaghiele,M. Morgante, C. Speri- sen, B. Ziegenhagen, S. Scannerini,A. Baker, B. W. Charlwood, C. Damiano, C. Franz, S. Gianinizzi, 1998: Chloroplast microsatellites reveal high levels of genetic diversity in conifers: a new tool for biodiversity analysis in forest ecosystems, Acta Horticultu- rae, 457: 395-401. Vendramin, G. G., B. Degen, R. J. Petit, M. Anzidei, A. Madaghiele, B. Ziegenha- 5. LITERATURA - References 356 |
| ŠUMARSKI LIST 7-8/2003 str. 27 <-- 27 --> PDF |
D. Ballian: PROCJENA GENETIČKE VARIJABILNOSTI OBIČNE JELE (Abies alba Mili.) ... Šumarski list br. 7-8, CXXVII (2003). 347-357 gen, 1999: High level of variation at Abies alba Ziegenhagen,B.,A. Kormut´ak,M. Schauer- chloroplst microsatellite loci in Europe, Mole- te, F. Scholz, 1995: Restriction site polymor- cular - Ecology, 8 (7): 1117-1126. phism in chloroplast DNA of silver fir {Abies Vendramin, G. G., M. Anzidei, A. Madag- alba Mill), Forest Genetics, 2 (2): 99-107. hiele, C. Sperisen, G. Bucci, 2000: Chlo- Ziegenhagen, B., M. Schauerte, A. Kor- roplast microsatellite analysis reveals the pre- mut´ak,F. Scholz, 1996: Plastid DNA poly- sence of population subdivision in Norway spru- morphism of megagametophytes and pollen in ce (Picea abies Karst.), Genome, 43: 68-78. two Abies species, Silvae Genetica, 45 (5-6): Vukelić, J., D. Baričević, 2001: Šumske zajed- 355-358. nice obične jele u Hrvatskoj, ed. Obična jela u Hrvatskoj, Zagreb, 162-186. SUMMARY: This research was aimed at establishing the molecular-genetic variability of some populations of silver fir in Croatia and Bosnia & Herzegovina (Vranića, Meka Brda, Gorski Kotar - adult, Gorski Kotar — juvenile, Crni Vrh, Cabulja, Orjen). Variability was shown using the analysis ofcp DNA, or more accurately, the number ofhaplotypes (H), effective number ofhaplotypes (Ne), and haplotype differential (Hexp & Sw.). The ep DNA analysis was used to study the haplotype variability of the silver fir. The obtained results show considerable differences among populations. With the use of chloroplast DNA, the number ofhaplotypes (H), the effective number of haplotypes (Ne), and the haplotype differential (Hexp & Sw), differences were found between the studied populations, and particularly between small, isolated and large populations. No major differences were established between adult and juvenile populations of Gorski Kotar (A & A). Since their genetic variability is insignificant, there are practically no differences in these populations. However, the results point to the need for a more detailed study at the molecular level. In order to set up and maintain genetic resources, a dense network of gene databases should be established both in situ and ex situ necessary for the preservation of genetic differences among populations. Accordingly, every ecological niche important for the silver fir should have its own genetic database with a corresponding number of units so that the eco-physiological characteristics of each population could be preserved. In managing natural resources and their renewal, natural regeneration should always be favoured, combined with constant monitoring of the genetic structure, so that proper measures could be undertaken to ensure the genetic variability that characterises every population. Future research should be directed at other populations of silver fir in Croatia and Bosnia and Herzegovina. An optimal number of individuals should be established in a sample. Management and regeneration of the silver fir should constantly be monitored and directed towards the maintenance of genetic differences within local populations. Moreover, numerous experiments should be conducted with different provenances in order to investigate eco-physiological properties of the silver fir. 357 |