DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 5     <-- 5 -->        PDF

IZVORNI ZNANSTVENI ČLANCI - ORIGINAL SCIENTIFIC PAPERS Šumarski list br. II 12, CXXII (1998), 491-506
UDK: 630* 165 + 168 + 48 (Querem minu)


UTJECAJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA
NA HRAST LUŽNJAK (Querem robur)*


THE INFLUENCE OF PHOSPHOGYPSUM FROM AN INDUSTRIAL
DUMP ON THE PEDUNCULATE OAK (Quercus robur)


Jadranka ROSA**


SAŽETAK: U neposrednoj blizini odlagališta fosfogipsa (područje kutinskog
bazena) primijećeno je sušenje i propadanje šuma hrasta lužnjaka, stoje
moguća posljedica utjecaja fosfogipsa iz odlagališta, nusprodukta koji nastaje
kod proizvodnje umjetnih gnojiva. Kemijska analiza vode iz odlagališta
pokazala je prisutnost teških metala (A l, Cd, i dr.), te izrazitu kiselost
(pH= 1,2-2,6). Hrast lužnjak u blizini odlagališta sa 60-70% oštećenosti krošnje
pripada kategoriji jako oštećenih stabala.


Za utvrđivanje promjena na stanicama hrasta lužnjaka proveden je kratkotrajni
test citotoksićnosti tretiranjem korjenćića hrasta lužnjaka isklijalih u
laboratoriju različitim razrijeđen/ima fosfogipsa iz odlagališta (od 0,5-10%).
Citogenetske analize provedene su u meristemskim stanicama vrškova korijena
klijanaca dobivenih izžireva sakupljenih ispod stabala bez vidljivih znakova
oštećen/a. Mjerenjem mitotske aktivnosti stanica korijena te vrste i učestalosti
kromosomskih aberacija, utvrđivan je stupanj citotoksićnosti nakon
24-satnog tretmana kao i oporavka. Kao negativna kontrola upotrijebljeni su
sijanci dobiveni izžireva sakupljenih u sjemenskoj sastojim.


Kao kontrolni test geno- i citotoksićnosti fosfogipsa iz odlagališta proveden
je Allium-test. Lukovice luka Allium ascalonicum isklijavane su u vodovodnoj
vodi, a zatim tretirane jednakim razrijeđenjima fosfogipsa iz odlagališta i
u jednakom razdoblju kao i hrast lužnjak. Kao negativna kontrola poslužile su
lukovice isklijavane u vodovodnoj vodi, dok su kao pozitivna kontrola poslužile
lukovice tretirane hidrazid maleinskom kiselinom.


Radi utvrđivanja neposrednog utjecaja odlagališta fosfogipsa na citogenetičke
promjene u hrasta lužnjaka, provedena su istraživanja na meristemskim
stanicama vrškova korjena sijanaca isklijalih iz žireva sakupljenih sa stabala
hrasta lužnjaka u neposrednoj blizini odlagališta, a kao negativna kontrola
poslužili su sijanci dobiveni iz žireva sakupljenih u sjemenskoj sastojim.


Nakon stoje utvrđena povećana količina fluorida u Ušću hrasta lužnjaka
uz odlagalište, analizirana je i morfologija epikutiku/arnog voska na uzorcima
lišća u različitim razvojnim stadijima, primjenom skenirajućeg elektronskog
mikroskopa. Provedena analiza ukazala je na postojanje povezanosti količine
fluorida u Ušću hrasta lužnjaka i stupnja degradacije epikutikularnog
voska.


K Ij u č n e r ij e č i: Test citotoksićnosti, Allium-fev?, mitotske i subkromatidne
aberacije, epikutikularni vosak elektronska mikroskopija (SEM).


*Magistarski rad, skraćeno za Šumarski list
**Mr. se. Jadranka Rosa "I Irvatskc šume" p.o. Zagreb




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 6     <-- 6 -->        PDF

J. Rosa: UTJECAJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Querem robur) Šumarski list br. 11-1 2. CXXII (1998). 4" I-506
UVOD - Introduction


Propadanje šuma sve je naglašeniji problem u Republici
Hrvatskoj. Skladištenje tehnološkog otpada u blizini
šuma dodatno ugrožava šumske ekosustave. Propadanje
šume hrasta lužnjaka u blizini industrijskog
odlagališta fosfogipsa vjerojatno je posljedica neposrednog
utjecaja.


Istraživanja utjecaja zračnog zagađenja na genom
šumskog drveća uspješno su provedena u Sloveniji na
smreci {Picea abies L.), (Druškovič, 1988b, Bavcon
i sur. 1993. Slična istraživanja provedena su i u
Austriji (Müller i sur. 1991).


Propadanje šuma hrasta lužnjaka sve se više povezuje
s atmosferskim zagađenjem. Istraživanja odnosa
oštećenja krošanja hrasta lužnjaka i stupnja oštećenja
genetičkog materijala provedena su na hrastu lužnjaku
iz okolice Bjelovara (Zol do š i sur., 1994a, 1994b).


Jedan od najstarijih i najčešće upotrebljavanih biljnih
testova za proučavanje djelovanja različitih kemijskih
spojeva na genom viših biljaka je Allium-test, kojegje
1938. godine uveo Levan, upotrijebivši korjenčiće
zdravih lukovica običnog luka (Allium čepa L.).
Allium-test pokazao se pogodan za utvrđivanje inhibicije
rasta korjenčića, kromosomskih aberacija, kao i za
ispitivanje djelovanja raznih supstanci iz okoliša na
proces mitoze (Fi skesj ö, 1985).


Razvoj suvremenih istraživačkih tehnika, poglavito
elektronske mikroskopije, omogućio je neposredan livid
u finu strukturu biljnih stanica, što je doprinijelo


boljem razumijevanju grade i funkcija lista kao organa.
U sklopu istraživanja tih struktura osobito su značajna
saznanja o kutikuli i epikutikularnom vosku.


Različiti zračni zagađivači i kisele kiše mogu neposredno
ili posredno poremetiti normalno izlučivanje
epikutikularnog voska. To smanjuje obrambenu funkciju
lista (zaštitu od pojačanog ultraljubičastog i infracrvenog
zračenja, kukaca, gljiva) i narušava regulaciju
vode u biljci (Baker, 1973). Krajnja posljedica svih
tih promjena može biti rano opadanje lišća i iglica. Iz
ovih razloga su istraživanja utjecaja različitih zagađivača
iz okoliša na površinske strukture lista sve zastupljenija
u ekologiji. Svjetska istraživanja oštećenja
šumskog drveća najopsežnije su provođena analizom
iglica crnogorice. U Norveškoj je istraživan utjecaj
ozona na epikutikularni vosak iglica bora (Barne s i
sur., 1988). Suvremeni rasterski elektonski mikroskop
(Scanning Electron Microscope-SEM) omogućio je
površinsku analizu mikromorfoloških značajki lišća.
Na taj način prepoznate su strukturne promjene površine
iglica različitih crnogoričnih vrsta, koje su posljedica
zračnog zagađenja (Huttunen i Laine, 1983;
Sauter iVass, 1986).


Upotreba Scanning elektronskog mikroskopa u istraživanjima
epikutikularnog voska listova u Republici
Hrvatskoj je u početnoj fazi. Za sada su tom metodom
provedena istraživanja površine lišća, primjerice nekih
hrastova (B a č i ć, 1996; 1997a) i jele (B a č i ć, 1998).


2. MATERIJAL I METODE - Material and methods
Biljni materijal upotrijebljen za istraživanja uzet je iz
neposredne blizine odlagališta fosfogipsa i sjemenske
sastojine udaljene 2 km od odlagališta, kao kontrole.
Izbor biljnog materijala napravljen je prema izgledu i
stanju sastojine hrasta lužnjaka (Quercus robur L.) u cjelini,
te osutosti krošnje pojedinih stabala. Izabrana stabla
neposredno uz odlagalište imala su osutost krošnje 2. i 3.
stupnja, što znači da su srednje do jako oštećena, dok su
stabla iz kontrolne sastojine 0. stupnja, tj. nisu imala
znakove oštećenosti krošnje. Stabla hrasta lužnjaka s kojih
su sakupljani uzorci stara su 120 godina.


Test citotoksičnosti proveden je na žirevima hrasta
lužnjaka isklijavanih u vodovodnoj vodi u staklenkama
na sobnoj temperaturi. Sijanci s dobro razvijenim korijenjem
tretirani su 24 sata otopinama procesne vode iz
odlagališta u razrijeđen)ima od 0,5%, 1,0%, 2,5%, 5% i
10%. Kao negativna kontrola upotrijebljeni su sijanci
isklijavani u vodovodnoj vodi. Jedan dio korjenčića nakon
tretmana stavljen je ponovno u vodovodnu vodu
radi oporavka koji je trajao 24 sata. Nakon tretmana i


oporavka, korjenčići su fiksirani u mješavini etilnog alkohola
i ledene octene kiseline u omjeru 3:1.


Za praćenje promjena u mitozi upotrijebljeni su sljedeći
parametri: mitotski indeks (broj stanica u mitozi/
ukupan broj stanica), učestalost i tipovi kromosomskih
aberacija.


Utjecaj otpadne vode iz odlagališta na tijek mitoze i
pojavu kromosomskih aberacija istraživan je upotrebom
testa citotoksičnosti na biljkama hrasta lužnjaka
isklijalih iz žireva sakupljenih u sjemenskoj sastojini, te
Allium-testa. Za Allium-test upotrijebljene su lukovice
luka Allium čepa var. ascalonicum.


Za analizu genotoksičnosti, lukovice su naklijavane
u vodovodnoj vodi. Nakon što su korjenčići narasli do
dužine 1 cm, lukovice su tretirane otopinama procesne
vode iz odlagališta u razrijeđenjima od 0,5%, 1%, 5% i
10%. Lukovice koje su rasle u vodovodnoj vodi predstavljale
su negativnu kontrolu. Kao pozitivna kontrola
poslužile su lukovice tretirane 1 x 104 IVI otopinom hidrazida
maleinske kiseline (Pavlic a i sur., 1995).




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 7     <-- 7 -->        PDF

J. Rosa: UTJECAJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Querem mhur) Šumarski list br. II 12, CXXH (1998). 491-506
Tretman je trajao 24 sata. Nakon tretmana dio korjenčića
je fiksiran, dok je drugi dio materijala prebačen u vodovodnu
vodu na 24-satni oporavak te zatim fiksiran.


Utvrđivanje neposrednog citotoksičnog utjecaja odlagališta
fosfogipsa na tijek mitoze i pojavu kromosomskih
aberacija proveden je na sijancima žireva sakupljanih
sa stabala uz samo odlagalište i isklijavanih u
laboratoriju. Kao kontrola upotrijebljeni su sijanci iskliljavani
iz žireva sakupljenih u sjemenskoj sastojini.


Za utvrđivanje količine fluorida upotrijebljeno je
lišće hrasta lužnjaka ubranog u središnjem dijelu krošnje
stabala neposredno uz odlagalište, te iz sjemenske
sastojine. Korištena je potenciometrijska metoda koja
se temelji na uporabi selektivne fluoridne elektrode s
kristalom lantana koji daje elektrokemijski impuls na
koncentraciji fluorida od 106 M.


Morfološke promjene epikutikularnog voska analizirane
su na uzorcima lišća stabala uz odlagalište i iz
sjemenske sastojine u vegetacijskoj sezoni 1996. godine.
Analizirana su 4 razvojna stadija lista i to lišće na
početku vegetacijske sezone, uključujući listove iz sastava
pupa, vrlo mlade i potpuno razvijene listove, kao i
lišće s kraja vegetacijskog razdoblja.


Analiza morfologije epikutikularnog voska na stomatalnom
obrubu puci lišća hrasta lužnjaka provedena
je skenirajućim elektronskom mikroskopijom (SEM).


Radi ocjenjivanja stupnja degradacije kristalnog epikutikularnog
voska (ThijsseiBass,l 990; B a č i ć
i sur., 1996) određivana je relativna količina amorfnog
voska u obliku krasta na stomatalnom obrubu prema
sljedećim stupnjevima:


1. stupanj - puci s obrubom koji je prekriven samo s
kristalnim (bez krasta) voskom.
2. stupanj - puci s obrubom koji je prekriven amorfnim
voskom u količini od 1-20%.
3. stupanj - puci s obrubom koji je prekriven amorfnim
voskom u količini od 21-60%
4. stupanj - puci s obrubom koji je prekriven amorfnim
voskom u količini od 61 -80%
5. stupanj - puci s obrubom koji je prekriven amorfnim
voskom u količini od 81 -100%
Za svaku analiziranu puč odredenaje pripadnost jednom
od navedenih stupnjeva. Stupnjevi od 1.- 4. su stupnjevi
fuzije i aglomeracije kristalnog u amorfni vosak.


Radi utvrđivanja statističkog odstupanja u mitotskoj
aktivnosti u odnosu na kontrolu primijenjen je x2- test
za analizu varijance. Kod usporedbe stupnjeva fuzije i
aglomeracije kristalnog u amorfni epikutikularni voska
(kraste) na lišću hrasta lužnjaka uz odlagalište i u kontroli,
korištenje test sa slijedovima (run-test). Radi se o
neparametarskom testu za usporedbu dvaju uzoraka
kod kojeg nije potrebno poznavati razdiobu populacije.


3. REZULTATI Results
Tretiranje korjenskih meristemskih stanica klijanaca
hrasta lužnjaka različitim koncentracijama vode iz
odlagališta fosfogipsa, rezultiralo je pojavom tri tipa
kromosomskih aberacija:


1. Aberacije na razini kromosoma
a) lutajući kromosomi
b) mikronukleus
2. Aberacije na razini diobenog vretena
a) c - mitoza
b) višepolarnost diobenog vretena
3. Subkromatidne aberacije
a) sljepljenost kromosoma
Citotoksično djelovanje istraženo je utvrđivanjem
ukupnog broja kromosomskih aberacija i mjerenjem
mitotske aktivnosti. Mitotska aktivnost ili mitotski indeks
(M.I.) iskazana je kao broj stanica u diobi u odnosu
na ukupni broj ispitivanih stanica.
Kod tretmana uzoraka različitim koncentracijama
fosfogipsa uočena je općenito slaba diobena aktivnost
meristemskih stanica (tablica 1). Najaktivnija dioba
stanica odvijala se kod tretmana 2,5 %-tnom koncentra


čijom kod koje je M.I. bio 3,59%. Tretman većim koncentracijama
(5 i 10%) doveo je do značajnog smanjenja
mitotske aktivnosti. Analiza je pokazala daje mitotska
aktivnost kod meristemskih stanica u svim koncentracijama
bila niža od mitotske aktivnosti kontrolnog
uzoraka kod kojeg je iznosila 4,34%.


Nakon 24 sata tretmana, ukupan broj kromosomskih
aberacija bio je značajan u odnosu na kontrolni uzorak
kod kojeg nije uočena pojava kromosomskih aberacija.
Povećanjem koncentracije do 5% povećavala se mitotska
aktivnost, a i broj aberacija bio je dvostruko veći.
Nakon tretmana 5 i 10%-tnom otopinom mitotska aktivnost
se smanjila, kao i broj kromosomskih aberacija.
Uočene su aberacije na razini diobenog vretena i kromosoma
(tablica 2). Poremećaji diobenog vretena očitovali
su se u velikom broju c-mitoza (slika 1 a), posebice
kod koncentracije od 2,5% te lutajući kromosomi
(slike lc, d, e). Uočeno je također sljepljivanje kromosoma
(slika lf), te mikronukleusi, kao siguran pokazatelj
eliminacije kromosomskog materijala. Pojava mikronukleusa
uočena je samo kod koncentracije od
1,0%. (Tablica 2).




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 8     <-- 8 -->        PDF

.1. Rosa: UT.ILCAJ FOSFOG1PSA I/. INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Qiwrnix robur) Šumarski list br. II 12, CXX11 (1998). 491-506


Tablica 1. Mitotska aktivnost i ukupan broj kromosomskih aberacija kod klijanaca hrasta
lužnjaka tretiranih 24 sata različitim koncentracijama fosfogipsa.


Koncentracija Kiselost Ukupan Broj stanica MI .
(%) (pH) broj stanica u mitozi (%)
Kontrola 7,0 7444 323 4,34
0,5 6,4 6766 181 2,67*
1,0 6,0 3709 39 1,05*
2,5 5,8 6383 298 3,59
5,0 4,4 4416 11 0,25*
10,0 4,1 2666 50 1,87*


Broj stanica s
kromosomskim
aberacijama
-
4
18
20
10
16


* Statistički signifikantna razlika u odnosu na kontrolu (provjereno x2 testom za p< 0,05).
Tablica 2. Tipovi kromosomskih aberacija kod klijanaca hrasta lužnjaka tretiranihkoncentracijama fosfogipsa.
Koncent. Ukupan M. I. MITOTSKE I KROMOSOMSKE ABERACIJE
24 sata različitim
Ukupan


(%) broj (%)
stanica
C-Višepolarno
mitoza diobeno vreteno
Kontrola 7444 4,34
0,5 6766 2,67 4
1,0 3709 1,05 12
2,5 6383 3,59 13 2
5,0 4416 0,25 10
10,0 2666 1,87 16


Nakon 24-satnog oporavka klijanaca hrasta lužnjaka
u vodovodnoj vodi nije došlo do značanije promjene
mitotske aktivnosti (tablica 3). Mitotska aktivnost
značajnije pada kod oporavka nakon tretmana većim
koncentracijama. Najniža mitotska aktivnost bila je
nakon oporavka uzoraka tretiranih 5%-tnom koncentracijom
fosfogipsa.


Nakon 24-satnog oporavka ukupan broj aberacija
značajno se smanjio, osobito broj c-mitoza (tablica 4).
Međutim značajno je porastao broj sljepljenih kromosoma,
dok pojava mikronukleusa nije uočena. Gotovo kod
svih koncentracija uočeno je sljepljivanje kromosoma.


Test na klijancima hrasta lužnjaka, isklijalih iz žireva
sakupljenih u sastojini neposredno uz odlagalište i
sjemenske sastojine kao kontrole, ukazao je značajan
broj mitotskih aberacija kod klijanaca uz odlagalište
(tablica 5). Najviše je bilo sljepljenih kromosoma i višepolarno
diobeno vreteno. Od analiziranih 19130 stanica
u kontroli, uočene su samo dvije mitotske aberacije,
sljepljivanje kromosoma i poliploidija.


broj
aberacija
Lutajući Sljepljeni Mikronukleus
kromosomi kromosomi


4


6 18


2 3 20


10


16


Provedeni Allium test ukazao jena geno-i citotoksičnost
fosfogipsa. S porastom koncentracije smanjivao
se rast korjenčića, ali se povećavao broj i učestalost
kromosomskih aberacija.


Nakon 24-satnog teretmana nije uočena velika razlika
u odvijanju mitotske aktivnosti u odnosu na negativnu
(vodovodna voda) ili pozitivnu kontrolu (hidrazid
maleinske kiseline) (tablica 6). Kod svih koncentracija
mitotska aktivnost bila je oko 6.6%, osim kod tretmana
0,5%-tnom koncentracijom kod kojih je mitotska aktivnost
bila veća (9,24%). Složeni kemijski sastav otpadne
vode kao i njena kiselost, utjecali su na pojavu sljepljivanja
kromosoma te anafaznih mostova kao posljedica
sljepljivanja (slika 2d). Takoder je uočena fragmentacija
kromosoma (slika 2e). Mitotske aberacije
kao posljedica djelovanja na diobeno vreteno - višepolarna
anafaza i lutajući kromosomi (slika 2a, b) uočene
su u puno manjem broju od kromosomskih aberacija
(tablica 7).




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 9     <-- 9 -->        PDF

J. Rosa: UTJECAJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Quercus rohur) Šumarski list br. II 12, CXXI1 (199X), 491-506


H


,^Of´ flp - i »

i


4 & M % W ?
-..
f. .


Su


*H".


C -*.«r* * "* ´T * f < ;.


* ^*


I^*J


Sr^^l


*


Slika l.Mitotske i kromosomske aberacije u
stanicama vrška korjena hrasta lužnjaka
nakon 24-satna tretmana različitim
koncentracijama fosfogipsa: a) c-mitoza,
b) višepolarna anafaza, c) i d) lutajući
kromosomi u metafazi, e) anafazni
most i zaostajući kromosomi i f)
sljepljeni kromosomi u metafazi.
Cr.= 10u.m.


Tablica 3. Mitotska aktivnost i kromosomske aberacije kod klijanaca hrasta lužnjaka nakon
24-satnog oporavka u vodovodnoj vodi.


Koncentracija Ukupan Stanice u MI . Broj stanica s
(%) broj
stanica
mitozi (%) kromosomskim
aberacijama
Kontrola 3163 149 4,71 -
0,5 3316 81 2,44* 2
1,0 3757 86 2,28* 4
2,5 2395 38 1,59* 9
5,0 2309 22 0,95* 4
10,0 2762 38 1,37* 7


* Statistički signifikantna razlika u odnosu na kontrolu (provjereno yj testom za p< 0,05).


ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 10     <-- 10 -->        PDF

.1. Rosa: UT.IHCA.I FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Qucirus iiilmr) Šumarski list hr. II 12, CXXII (1998). 491-506


Tablica 4. Učestalost mitotske aktivnosti i tipovi kromosomskih aberacija kod klijanaca hrasta lužnjaka nakon 24satnog
oporavka u vodovodnoj vodi.


Koncent. Ukupan M.I. MITOTSKE I KROMOSOMSKE ABERACIJE Ukupan
(%) broj
stanica
(%) broj
aberacija
C-mitoza Višepolarno Lutajući Sljepljeni
diobeno vreteno kromosomi kromosomi
Kontrola 3163 4,71
0,5 3316 2,44 2 2
1,0 3757 2,28 2 2 4
2,5 2395 1,59 5 2 2 9
5,0 2309 0,95 1 1 2 4
10,0 2762 1,37 4 3 7


Tablica 5. Mitotska aktivnost, broj i vrste aberacija u kontrolnoj sastojini i neposredno uz odlagalište


Sastojina Brojuzoraka
Ukupan
brojstanica
Broj
stanica
u mitozi
M. I.
(%) Cmitoza
MITOTSKE I KROMOSOMSKE ABERACIJE
Višepolarno
diobeno
Lutajući
kromosomi
Sljepljeni
kromosomi
Poliploidija
Ukupan
Broj
aberacija
Aberacije
(%)
vreteno
1 6048 174 2,88 1 1 2 1,15
2 4524 107 2,36
Kontrolna 3 1237 8 0,65
4 4950 137 2,77
5 2371 29 1,22
Ukupno 5 19130 455 2,38 1 1 2 0,44
1 3346 45 1,34 2 2 4,44
2 3938 21 0,53 1 1 4.76
Uz* 3 1170 20 1,71 1 2 2 5 25,0
odlagalište 4 6044 352 5,82 1 1 0,28
5 1995 106 5,31 1 1 2 1,89
6 4069 15 0,37 1 1 2 13,4
7 2562 74 2,89 3 3 4,05
Ukupno 7 23124 633 2,74 1 6 3 6 16 2,53


Nije ustanovljena statistički signifikantna razlika u odnosu na kontrolu (provjereno x2 testom za p< 0,05).


Nakon 24-satnog oporavka mitotska aktivnost u Rezultati analize fluorida u lišću hrasta lužnjaka
meristemskim stanicama luka kod svih koncentracija ukazali su na značajno povećanje u lišću neposredno uz
nije se značajnije smanjila, te je i dalje bila oko 6,0 % odlagalište (8,49 ppm) za razliku od kontrole gdje je za(
tablica 8). Mitotska aktivnost značajnije se povećala bilježena količina od 1,82 ppm.
samo prilikom oporavka nakon tretmana 0,5%-tnom SEM istraživanja pokazala su daje površina listova
koncentracijom (7,79 %). Ukupan broj kromosomskih hrasta lužnjaka iz sastava pupa, neposredno uz odlagaaberacija
se smanjio, a od vrsta kromosomskih aberacilište
fosfogipsa kao i iz kontrolne sastojine, prekrivena
ja najviše je bilo sljcpljenih kromosoma i mostova u isključivo epikutikularnim voskom u obliku tankog hoanafazi
i telofazi. Od mitotskih aberacija najviše je uomogenog
sloja (slika 3a). Kristalni vosak na tim listovičeno
višepolarnih anafaza (tablica 9). Takoder je znama
nije nađen. Površina vrlo mladih, tek proliferiranih
čajno smanjen broj c-mitoza. listova, uključujući stomatalni obrub puci, na oba je




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 11     <-- 11 -->        PDF

.1. Rosa: UTJECAJ KOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Qiwrciis mbur) Šumarski list hr. II 12, CXXI1 (1W8), 491-506


Tablica 6. Mitotska aktivnost i kromosomske aberacije u meristemskim stanicama luka nakon 24 sata tretmana.


Konc Broj Broj MI . Broj kromosomskih aberacija Ukupno
analiz. stanica u
(%) stanica diobi (%) ljeplivost
kromosoma
Mostovi u anafazi/
telofaz
Fragmenti Mikronukleusi
NK 2574 173 6,72 0 9 0 0 9
PK 2039 136 6,66 0 9 22 77 198
0,5 2175 201 9,24* 2 10 3 1 16
1,0 3136 211 6,72 12 11 7 4 34
5,0 2975 206 6,92 5 11 6 2 24
10,0 2545 169 6,64 4 5 6 3 17


NK - negativna kontrola (vodovodna voda)
PK - pozitivna kontrola (hidrazid maleinske kiseline, 1 x 104 M


* Statistički signifikantna razlika u odnosu na kontrolu (provjereno %2 testom za p< 0,05).
Tablica 7. Mitotska aktivnost i mitotske aberacije u meristemskim stanicama luka nakon 24 sata tretmana.


Konc. Broj Broj M L Broj mitotskih aberacija Ukupno
(%) analiz. stanica u
stanica diobi (%) C-Lutajući Višepolarna
mitoza kromosomi anafaza


NK 2574 173 6,72 0 0 0 0
PK 2039 136 6,66 0 6 0 6
0,5 2175 201 9,24* 0 1 1 2
1,0 3136 211 6,72 5 4 2 11
5,0 2975 206 6,92 2 3 0 5
10,0 2545 169 6,64 2 2 0 4


Statistički signifikantna razlika u odnosu na kontrolu (provjereno yj testom za p< 0,05).


Tablica 8. Mitotska aktivnost i kromosomske aberacije u meristemskim stanicama luka nakon 24 sata oporavka.


Konc. Broj Broj MI . Broj kromosomskih aberacija Ukupno
analiz stanica u
(%) stanica diobi (%) ljepljivost Mostovi u anafazi/ Fragmenti Mikronukleusi
kromosoma telofazi
NK 2760 190 6,88 0 0 0 0 0
0,5 2386 186 7,79* 2 1 0 1 4
1,0 2795 186 6,65 8 1 2 1 12
5,0 2117 108 5,10* 0 0 1 1 2
10,0 2772 178 6,42 6 9 3 4 22


Statistički signifikantna razlika u odnosu na kontrolu (provjereno yj testom za p< 0,05).




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 12     <-- 12 -->        PDF

.1. Koša: UTJKC´AJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Quercus rohur) Šumarski list br. 11 12. CXX11 (1998). 491-506


f %\


*´!


\ ,y


%


V


»


Slika 2. Mitotske i kromosomske aberacije u stanicama vrška luka A. čepa. var. ascalonicum nakon 24-satna tretmana različitim koncentracijama
fosfggipsa: a) lutajući kromosomi u anafazi, b) višepolarna anafaza, c) metafaza s kromosomskim fragmentima d) anafazni
mostovi. Cr.= 10um


Tablica 9. Mitotska aktivnost i mitotske aberacije u meristemskim stanicama luka nakon
24 sata oporavka.


Konc. Broj Broj M.I. Broj mitotskih aberacija Ukupno
analiz stanica u
(%) stanica diobi (%) CLutajući
Višepolarna
mitoza kromosomi anafaza
NK 2574 173 6,88 0 0 0 0
0,5 2175 201 7,79* 0 1 1 2
1,0 3136 211 6,65 1 2 4 7
5,0 2975 206 5,10* 0 0 2 2
10,0 2545 169 6,42 0 4 5 9


* Statistički signifikantna razlika u odnosu na kontrolu (provjereno %2 testom za p< 0,05).


ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 13     <-- 13 -->        PDF

J. Rosa: UTJECAJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Querem rolmr) Šumarski list br. II 12. CXX1I (1998). 491-506
Slika 3. Scaning elektronska snimka pući listova hrasta lužnjaka (Quercus robur L.)


a) puč na listu iz sastava pupa iz sjemenske sastojine; na stomatalnom obrubu nema kristala epikutikularnog voska, (x 3100).


b) puč na sasvim mladom, tek proliferiranom listu uz odlagalište; stomatalni obrub prekriven je isključivo kristalima epikutiku


larnog voska (0.-stupanj), (x 3100).


Slika 4. Scaning elektronska snimka puci listova hrasta lužnjaka (Quercus robur L.)
a) puč na sasvim mladom, tek proliferiranom listu, uz odlagalište; na stomatalnom obrubu je amorfna krasta u količini do 20%
(1 .-stupanj degradacije), (x 3540).
b) puč, dolje lijevo, na sasvim mladom, tek proliferiranom listu, uz odlagalište; na stomatalnom obrubu je amorfna krasta u količini
od 21 % - 50%(2.-stupanj degradacije), (x 1550).


Slika5. Scaning elektronska snimka puci na potpuno razvijenom listu hrasta lužnjaka (Quercus robur L.) uz odlagalište; na slici su vidljive
hife gljiva, (x 1550).
a)izdvojena puč iz slike 5. (donji red desno); stomatalni obrub prekriven je amorfnom krastom u količini od 51%-80% (3.-stupanj


degradacije).
b)izdvojena puč iz slike 5. (gornji red sredina); stomatalni obrub prekriven je amorfnom krastom u količini od 81%-100%
(4.-stupanj degradacije).




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 14     <-- 14 -->        PDF

J. Rusa: UTJECAJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST´ LUŽNJAK (Querem robiir) Šumarski list br. II- 12, CXXII (I99S), 491-506
Post. puči (%)
55


50


45


40


35


30


25


20


15


10


5


0


0 stupanj 1 stupanj 2 stupanj 3 stupanj 4 stupanj
a)


E3() stupanj 1 stupanj LJ 2 stupanj 3 stupanj H 4 stupanj


Post. puči (%)
35 r
30


25


20


15


0 stupanj 1 stupanj 2 stupanj 3 stupanj 4 stupanj


0 stupanj * 0 stupanj ™
2 stupanj 3 stupanj 4 stupanj


b)
D


Slika 6. Histogram] postotka puči listova hrasta lužnjaka kristalnim (0. stupanj) i amorfnim voskom u obliku krasta (1 .-4. stupanj) na
b) stomatalnom obrubu puči listova uz odlagalište fosfogipsa
c) na stomatalnom obrubu puči listova iz sjemenske sastojine (kontrola)


staništa pak prekriven samo kristalnim voskom (0. stukristalnim
voskom (0. stupanj) i postotak puči s kristalpanj;
slika 3b). Faze degradacije kristalnog u amorfni nim i amorfnim voskom (1.-4. stupanj degradacije) na
vosak u tom razvojnom stadiju lista nisu zapažene. Kastomatalnom
obrubu s listova neposredno uz odlagaliko
se list razvijao i rastao do konačnog oblika i dužine, šte (slika 5a) i s listova iz sjemenske sastojine (slika
kristali voska na listovima s obje lokacije postupno su 5b). Neparametarskom usporedbom, primjenom tzv.
se tuzionirali i aglomerirali u amorfne kraste (1. - 4. sturun
testa, uzoraka sastojine uz odlagalište i sjemenske
panj degradacije; slika 3a i b, 4a i b). Međutim, početak sastojine, pokazalo se da medu uzorcima postoji znai
intenzitet degradacije bili su različiti s obzirom na stačajna
razlika i bez primjene statističkih testova. Naime,
nište. Uz odlagalište fosfogipsa fuzija i aglomeracija očigledan je značajno visok postotak puči s 4. stupnjem
kristalnog voska počinjala je ranije i bila je izraženija. degradacije kristalnog voska na listovima uz odlagaliNa
tom su staništu osobito znatno ranije počeli 3. i 4. šte, dok 4. stupanj degradacije na pucima listova iz sjestupanj
degradacije. 4. stupanj degradacije zabilježen menske sastojine, kako je već spomenuto, uopće nije
je samo na lokaciji uz odlagalište. zabilježen. Postotak puči s 1., 2. i 3. stupnjem degradacije
kristalnog voska, poglavito drugim, bio je znatno


Kvantitavna analiza degradacije kristalnog voska u


niži uz odlagalište fosfogipsa (slika 6a i b).


amorfni vosak također je ukazala na razlike između sastojina.
Na slici 5a i b prikazanje postotak puči samo s




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 15     <-- 15 -->        PDF

J. Rosa: UTJECAJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Quen-us rohur) Šumarski list hr. II 12, CXXII (1998), 491-506
RASPRAVA - Discussion


U ovom radu ponajprije je istraživana citotoksičnost,
odnosno učinak različitih koncentracija fosfogipsa
iz odlagališta na proces mitoze i pojavu kromosomskih
aberacija u meristemskim stanicama hrasta lužnjaka.
Istražen je i utjecaj fosfogipsa na klijance hrasta
lužnjaka dobivene iz žireva sakupljenih na staništu uz
odlagalište fosfogipsa, te iz žireva sjemenske sastojinc
kao kontrole.


Citogenetičke analize meristemskih stanica vrška
korjenčića hrasta lužnjaka nakon 24-satnog tretmana
pokazale su značajno smanjenje mitotske aktivnosti.
Samo kod tretmana 2,5%-tnom koncentracijom mitotska
aktivnost značajnije se razlikovala od kontrole. Uočene
su mitotske aberacije kao posljedica poremećaja
funkcije diobenog vretena i to c-mitotički učinak, koji
se porastom koncentracije povećavao, te višepolarno
diobeno vreteno. Takoder su uočeni mikronukleusi uz
interfazne jezgre.


Nakon 24-satnog oporavka nije došlo do značajnije
promjene mitotske aktivnosti. Mitotska aktivnost je i
dalje ostala relativno slaba, ali je primijećeno više kromosomskih
aberacija subkromatidnog tipa kao što je
sljepljivanje kromosoma. U manjem je broju uočena višepolarnost
u anafazi, dok mikronukleusi nisu uočeni.


U ovom je istraživanju mitostumulativan učinak
fosfogipsa na stanice hrasta lužnjaka bio opažen kod
koncentracije od 2,5%. Opaženi učinak ukazuje da fosfogips
u određenim koncentracijama možda može imati
i kancerogeni učinak, upravo zbog stimulativnog djelovanja
na staničnu diobu. Naime, dosadašnja istraživanja
upućuju na povezanost neoplastične transformacije
i nepravilne regulacije mitotskog ciklusa (Schle gel
iCraig, 1991).


Da bi se potvrdila osjetljivost hrasta lužnjaka, odnosno
mogućnost primjene te vrste u testovima genotoksičnosti,
u istraživanju je istovremeno korišten i Allium-
test, kao kontrolni test. Ovaj test provodi se od
1938. godine kada gaje uveo Levan, upotrijebivši
korjenčiće mladih lukovica običnog luka Allium čepa


L. Od tada pa sve do danas to je jedan od najčešće upotrebljavanih
testova za proučavanje djelovanja različitih
kemijskih spojeva na biljne kromosome (Fiske s
j ö, 1988). Allium-test se pokazao pogodan za utvrđivanje
kromosomskih i genomskih mutacija, a također i
za ispitivanje djelovanja različitih supstanci na proces
mitoze u cjelini. U novije vrijeme sve se češće koristi
kao standard za utvrđivanje prisutnosti genotoksičnih
zagađivača u prirodi (Fiskesjö, 1985; Rank i
Nielsen, 1997).
Rezultati dobiveni Allium-testom, ukazali su na toksičnost
fosfogipsa. Citogenetička analiza meristemskih
stanica luka nakon 24-satnog tretmana pokazala je mi


todepresivan učinak fosfogipsa. Izuzetak je bila koncentracija
fosfogipsa od 0,5% kod koje je došlo do značajnijeg
porasta mitotske aktivnosti. Slično djelovanje
uočili su Pape š i sur. (1989). Primjenom Allium-testa
za djelovanje herbicida cijanazina, utvrdili su da kod
kratkih tretmana (24 sata) male koncentracije cijanazina
djeluju mitodepresivno, dok u produljenim tretmanima
djeluju kao mitostimulansi. Samo kod visokih koncentracija
mitotska aktivnost bila je slaba. U našem je
istraživanju mitostumulativan učinak u stanicama luka
bio opažen kod koncentracije od 0,5% fosfogipsa, dok
je kod hrasta lužnjaka takav učinak imala 5x veća koncentracija
(2,5%). Opaženi učinak ukazuje da fosfogips
u određenim koncentracijama možda može imati i kancerogeni
učinak, upravo zbog stimulativnog djelovanja
na staničnu diobu.


Ova dva testa citotoksičnosti pokazala su postojanje
značajnih razlika u načinu i stupnju djelovanja fosfogipsa
na stanice hrasta lužnjaka i luka. Slični rezultati
ustanovljeni su usporednim istraživanjima utjecaja iona
teških metala (AF ) na stanice luka, smreke (Picea
abies L.), bukve i hrasta lužnjaka. Naime, ustanovljeno
je da nakon tretmana istim koncentracijama iona dolazi
do različitih degradacijskih oblika stanica kod istraživanih
vrsta. Kod smreke je uočen isti tip aberacija kao i
kod luka, ali tek nakon tretmana od devet dana, za razliku
od bukve i hrasta lužnjaka, kod kojih u istom razdoblju
i s istim tretmanom nisu uočene takve aberacije
(Fiskesjö, 1990).


Dobivene razlike u broju i vrstama kromosomskih
aberacija kod stanica hrasta lužnjaka u odnosu na stanice
luka mogle bi biti posljedice razlike u veličini kromosoma.
Dok kod luka veličina kromosoma iznosi od
6,42-12,76 Lim (Puizina , 1997), bjelogorične drvenaste
vrste imaju male kromosome, osobito hrast lužnjak
kod kojega veličina kromosoma iznosi od 2,49 do
6,26 um (O h r i i A h u j a, 1990). Budući da se smreka s
izrazito velikim kromosomima 7,5-12,5um (Papeš i
sur., 1997) pokazala vrlo osjetljiva na prisutnost štetnih
supstanci u okolišu, moglo bi se pretpostaviti da vrste s
malim genomom imaju veću razinu tolerancije prema
različitim kemijskim spojevima. Druškovi č (1988a;
1988b) je utvrdila da se s vidljivim znakovima oštećenja
na smreci povećava stupanj oštećenja genetičkog
materijala, koji se očituje u velikom broju kromosomskih
aberacija.


Provedena istraživanja pokazala su da tretmani istim
koncentracijama otopine fosfogipsa kod luka izazivaju
značajan broj kromosomskih aberacija, dok su kod
hrasta lužnjaka uglavnom opažane mitotske aberacije, i
to u puno manjem broju.


Glede rezultata testova provedenih u laboratorijskim
uvjetima na hrastu i luku, bilo je za očekivati da će


501




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 16     <-- 16 -->        PDF

.1. Koša: UTJECAJ FOSFOGIPSA I/. INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK {Querem mhur) Šumarski list br. 11-12. CXXII (1998), 491-506


slični rezultati biti potvrđeni citogenetičkim istraživanjima
klijanaca hrasta iz prirodnih staništa. Istraživanja
odnosa ekoloških uvjeta i oštećenja genetičkog materijala
provedena na meristemskim stanicama vrškova korijena
klijanaca iz žireva sakupljenih u blizini odlagališta
fosfogipsa i žireva sjemenske sastojine, ukazala su
na neke različitosti. Stabla uz odlagalište imala su vidljive
znakove oštećenja krošanja za razliku od kontrolnih.
Kod mitotske aktivnosti nije bilo značajnijih razlika,
uglavnom je ista bila jednaka ili nešto veća od
kontrolnog uzorka. U uzorcima sakupljenim uz odlagalište,
uočeno je više stanica s aberacijama. Najčešće su
to bili poremećaji u funkciji diobenog vretena. Slične
rezultate objavili su Zoldo š i sur., (1994; 1997; Be sendorf
er i sur. (1996) prateći tijek mitoze u meristemskim
stanicama klijanaca iz populacije hrasta lužnjaka
u okolici Bjelovara. Spomenuti autori uzimali su
uzorke ispod stabala od 0. do 4. stupnja oštećenja i pratili
pojavu kromosomskih aberacija, te su utvrdili da
postoji poremećaj funkcionalnosti diobenog vretena
kod stabala većeg stupnja oštećenja.


Dok su sve provedene citogenetičke analize na
crnogoričnim vrstama potvrdile veliku osjetljivost na
prisutnost gcnotoksičnih supstanci u okolišu, citogenetičke
analize na hrastu lužnjaku pokazale su se nedostatnima
za objašnjenja vidljivih znakova oštećenja.


Kako je hrast lužnjak dugoživuća vrsta i ima relativno
mali genom, svega 1,59 pg (Zoldo š i sur., 1997),
on pokazuje veliku razinu tolerancije prema prisutnosti
različitih genotoksičnih tvari u okolišu. Visoka razina
tolerancije hrasta lužnjaka potvrđena je i ovim istraživanjima
utjecaja fosfogipsa iz odlagališta. Pored toga,
odlagalište u svome sadašnjem kapacitetu postoji od
1987. godine, stoje očigledno kratko razdoblje za utvrđivanje
značajnijih citogenetičkih oštećenja.


Vidljiva oštećenja na hrastu lužnjaku vjerojatnije su
posljedica morfoloških i fizioloških poremećaja koji su
nastali od taloženja velikih količina fluorida iz okoliša.
Dosadašnja istraživanja na biljnom materijalu u područjima
velikih emisija fluorida ukazala su na izmijenjene
morfološke karakteristike i smanjenu sposobnost
plodonošenja(Klumpp i sur., 1994).


Utvrđena količina fluorida u lišću hrasta lužnjaka iz
staništa u blizini odlagališta fosfogipsa bila je značajno


ZAKLJUČAK


1. Citogenetičke analize provedene na klijancima
hrasta lužnjaka nakon 24-satnog tretmana fosfogipsom
iz odlagališta, ukazale su na smanjenu mitotsku aktivnost
u ovisnosti o razrijeđenjima i na pojavu aberacija u
odnosu na kontrolu. Samo kod koncentracije od 2,5 %
veća nego u lišću hrasta lužnjaka na staništu 2 km uda


ljenom od odlagališta.


Epikutikularni vosak na površini listova hrastova pri


marno je razvijen u obliku kristalnih listića, kristaloida


(engl. "Platelets") koji se nalaze na stomatalnom obrubu


puci, ali također i na površini periklinskih stijenki obi


čnih epidermalnih stanica. Obično su složeni okomito na


obrub puci. Tijekom vremena kristaloidi epikutikular


nog voska se fuzioniraju i aglomeriraju u amorfni vosak


koji je poznat pod nazivom amorfne kraste.


Istraživanja epikutikularnog voska pomoću rasterskog
elektronskog mikroskopa, u ovome radu ukazuju
na značajne razlike između listova dvaju staništa. Opažene
razlike odnose se na pojavu i količinu epikutikularnog
voska. Stanje epikutikularnog voska u prva dva
razvojna stadija lista neposredno uz odlagalište, kao i u
kontroli, bila je gotovo jednaka, dok je u višim stadijima
razvoja lista došlo do značajne razlike. 4. stupanj
degradacije epikutikularnog voska (pojava krasta u količini
od 81-100%) zabilježen je samo na pucima listova
uz odlagalište. Budući da su analizirani listovi iz obje
sastojine iste starosti, može se zaključiti daje proces
degradacije uz odlagalište tekao brže. Na osnovi
dobivenih rezultata može se pretpostaviti daje količina
fluorida u lišću uz odlagalište izazvala prijevremenu
degradaciji kristalnog epikutikularnog voska. To je moglo
utjecati na promjene fenotipskih karakteristika stabala
uz odlagalište i kao krajnji rezultat na smanjenje
vitalnosti stabala i sposobnosti prirodne reprodukcije.


Sličnu pojavu degradacije epikutikularnog voska
zabilježili su Bač ić i sur. (1997b), na iglicama alepskog
bora (Pinus halepensis Arnold.). Utvrđena je razlika
u izgledu puci i stanju epikutikularnog voska sa staništa
u blizini tvornice cementa u Solinu i onoga izvan
doticaja emisije cementne prašine. Dok je na iglicama u
blizini tvornice opažena i "erupcija voska" (porast produkcije
epikutikularnog voska), na kontrolnom uzorku
to nije uočeno. Autori su utvrdili povezanost između
produkcije epikutikularnog voska i količine čestica kalcija
iz cementne prašine taloženih na površini iglica.
Veliki dio puci ostao je blokiran uslijed nataložene cementne
prašine, što je rezultiralo pojačanim razvojem
amorfnog voska te preranim odbacivanjem iglica.


- Conclusion
uočeno je značajnije povećanje mitotske aktivnosti. S
povećanjem koncentracija povećavao se broj aberacija i
to puno učestalije bile su mitotske od kromosomskih.
Kod svih razrijeđenja pojavile su se aberacije i to uglavnom
c-mitoza i lutajući kromosomi, nastale kao rezultat




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 17     <-- 17 -->        PDF

.1. Rosa: UTJLCA.I FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Quereus ro/mr) Šumarski list br. 11-12, CXXII (1998), 491-506


poremećaja funkcije diobenog vretena. Učestalost i vrste
kromosomskih aberacija ovisile su o koncentracijama
fosfogipsa iz odlagališta. Nakon 24-satnog oporavka
kod svih koncentracija nije došlo do značajnije promjene
mitotske aktivnosti. Ona je i dalje ostala slaba, ali je
bilo više subkromatidnih od mitotskih aberacija. Najviše
je zabilježeno sljepljenih kromosoma.


2. Provedeni Allium-test ukazao je na geno- i citotoksičnost
fosfogipsa nakon 24-satnog tretmana kao i
nakon 24-satnog oporavka. Uočeno je zaostajanje rasta
korjenčića nakon petodnevnog tretmana provedenim
koncentracijama. U stanicama vrškova korjenčića tretiranim
svim koncentracijama, pojavile su se kromosomske
i mitotske aberacije. Od kromosomskih aberacija
najzastupljeniji su bili kromosomski prekidi, dok
su mitotske aberacije najčešće bile lutajući kromosomi
i c-mitoza. Usporedna analiza kromosomskih aberacija
u luka i hrasta lužnjaka ukazala je na učestalije kromosomske
aberacije u luka, dok su kod hrasta lužnjaka
učestalije bile mitotske promjene.


3. U stanicama vrškova korjenčića hrasta lužnjaka
neposredno uz odlagalište, kao i u kontroli nije bilo
značajnije razlike u mitotskoj aktivnosti, ali je ipak nešto
veća mitotska aktivnost utvrđena u klijancima uz odlagalište.
Međutim uočene su značajne razlike u broju
i vrsti mitotskih i kromosomskih aberacija. Najčešće su
to bili poremećaji u funkciji diobenog vretena.
4. U lišću hrasta lužnjaka neposredno uz odlagalište
utvrđena je povećana količina fluorida, što se može povezati
s pojavom degradacije kristalnog epikutikularnog
voska 4. stupnja, tj. razvojem amorfne voštane kraste
koja prekriva stomatalni obrub gotovo preko 50%
analiziranih puci listova u količini od 80-100%, a koja
u kontroli nije zabilježena.
Slika 7. Izgled kazeta u koje se odlaže fosfogips
Phoshogypsum and waste waters from factories in Kutina


Za rast i razvoj biljaka potrebni su mnogi makro i
mikro elementi, koji se u prirodi nalaze u oblicima nepristupačnim
biljkama. Stoga se pri proizvodnji mineralnih
gnojiva obradom prirodnih soli, hranjiva prevode
u oblik lakše pristupačan biljkama.


INA-Petrokemija d.o.o., Kutina, s ukupnom proizvodnjom
od 1,5 milijuna tona gnojiva godišnje, postala
je najveći proizvođač mineralnih gnojiva u ovom dijelu
Europe (Gosp. i okoliš, 1996. br. 5). Osnovne sirovine


za proizvodnju kompleksnih NPK gnojiva su fosfatne
rude, amonijak i kalijeve soli. Reakcijom fosfatne rude
i sulfatne kiseline nastaje fosfatna kiselina i fosfogips
kao tehnološki otpad. Fosfatna kiselina s amonijakom
daje amonijeve fosfate, a uz dodatak kalijevih soli nastaje
NPK kompleksno gnojivo. Fosfogips se kao 25 do
30%-tna vodena suspenzija hidraulički transportira od
postrojenja do odlagališta udaljenog 5 km od tvornice.




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 18     <-- 18 -->        PDF

J. Rosa: UTJKCA.I FOSFOGIPSA IX INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Oiieicus rubur) Šumarski list hr. 11-12, CXXII (1998), 491-506
LITERATURA References


B a č i ć, T. 1996: Note on use of some micro-morphological
features in distinction of three pubescent
oaks in Croatia. Acta Biologica Cracoviensia,
Series: Botanica 38, 67-72.


B a č i ć, T. 1997a: Comparative SEM investigations of
the abaxial leaf epidermis of Quercus cerris L.
var. cerris Lond. and Quercus cerris L. var. austriaca
(Willd.) Lond. from Croatia. Acta Biologica
Cracoviensia, Series: Botanica 39, 43-46.


Bačić,T., Lynch, A.H., Cutler, D. 1997b: Reactions
to cement factory dust contamination by Pi-
nus halepensis leaves. New Phytologist (u tisku).


Bačić, T., Popović, Ž. 1998: Preliminary report on
epicuticular wax surface condition on stomata of
Abies alba Mill, needles from National park
"Risnjak" in Croatia Acta Biologica Cracoviensia,
Series: Botanica (u tisku).


Baker , E. A. 1973: Chemistry andmorfology of plant
epicuticular waxes. Long Ashton Research Station,
University of Bristol, Bristol BS18 9AF.


Bavcon,J., Druškovič,B.,Papeš,D. 1994: Germination
of seeds and citogenetic analysis of the
spruce in differently polluted areas of Slovenia.
Phyton 33, 267-277.


Besendorfer, V., Zoldoš, V., Peškan, T., Krs nik-
Rasol, M., Littvay, T, Papeš, D.
1996: Identification of potential cytogenetical
and biochemical markers in bioindication of
common oak forests. Phyton (Horn, Austria)
36(3), 139-146.


D r u š k o v i č, B. 1988a: Citogenetska bioindikacija I-
Uporaba citogenetske analize pri odkrivanju delovanja
genotoksičnih polutantov na gozdno
drevje, Biološki Vestnik 36, 1-18.


Druškovič , B. 1988b: Citogenetska Bioindikacija II-
Prikaz načina ocenjivanja obremenjenosti genetskoga
Materiali in oceana ogroženosti smreke na
posamezni lokalitet, Biološki Vestnik 36, 31 -44.


F i s k e s j ö, G. 1985: The Allium test as a standard in environmental
monitoring. Heraditas 102, 99-112.


Fi skesj ö, G. 1988: The Allium test - an alternative in
envinomental studies: the relative toxicity of metal
ions. Mutation Research 197, 243-260.


F i s k e s j ö, G. 1990: Occurrence and degeneration of
"Al-structures" in root cap cells of Allium cepa


L. after A1-treatment. Hereditas 112, 193-202.
Fi skesj ö, G 1993: The Allium test in wastewater minitoring.
Envinomental Toxicology and Water
Quality, An International Journal 8, 291-298.


Huttunen, S., Laine, K. 1983: Effects of air-borne
pollutants on the surface wax structure of Pinus
sylvestris needles. Annales Botanici Fennici 20,
79-86.


Klumpp, A., Klumpp G. 1996: Fluoride impact on
native tree spcies of the atlantic forest near Cuba-
to, Brazil. Water, Air and Soil Pollution 87, 57-71.


Levan , A. 1938: The effects of colchicine on root mitosis
in Allium. Hereditas 24,471-486.


Müller, M.,Guttenberger,H., Grill, D., Druš kovič,
B., Paradiž, J. 1991: A cytogenetic
method for examining the vitality of spruces.
Phyton 31, 143-155.


Müller, M., Grill D., Guttenberger H. 1994a:
The effects of interactions between ozone and
C02 on the chromosomes of Norway Spruce root
Meristems. Phyton 34, 321-335.


Ohri, D.,Ahuja,M.R. 1990: Giemsa C-banded karyotype
in Quercus L. (Oak). Silvae Genetica 39,
216-219.


Papeš, D. Besendorfer, V., Bosiljevac, V.
1989: The Allium-test response to cyanazine.
Acta Bot.anica Croatica 48, 39-46.


Papeš, D., Jeli nie, S., Cerbah, M., Yakov lev,
S., S. 1997: Fluorescent chromosomal banding
in Picea omorika and P. abies. U: Borzan, Z.
Schlarbaum, S.E. (ed.), Cytogenetic Studies of
Forest Trees and Skrub Species. Proc. First
IUFRO Cytogenetics Working Party S2.04-08
Symposium, Brijuni 8-11,09.1993.103-109.


Pavlica, M., Puizina, J., Papeš, D. 1995: Differences
in response to Maleic hydrazide observed
in diploid and triploid shallot root-tip cells. Periodicum
Biologorum 97(4), 337-342.


P u i z i n a, J. 1997: Citogenetička i molekularno genetička
obilježja prirodnih, hibridnih i poliploidnih
formi crvenog luka (Allium cepa L.) Doktorska
disertacija. Sveučilište u Zagrebu, 1997.


Rank, J., Ni el sen, M.FI. \991:A Ilium cepa anaphase-
telophase root tip chromosome aberration assay
on N-methyl-N-nitrosourea, maleic hydrazide,
sodium azide, andethyl methanesulfonate.
Mutation Research 390, 121 -127.


Riding, R.T., Percy, K.E. 1985: Effects of S02 and
other air pollutants on the morphology of epicuticular
waxes on needles of Pinus strobus and Pinus
banksiana. New Phytology 99, 555-563.


Sauter, J.J., Voss, J.U. 1986: SEM-observations on
the structural degradation of epistomatal waxes




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 19     <-- 19 -->        PDF

J. Rosa: UTJECAJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Querem rohur) Šumarski list br. 11-12, CXXII (1998), 491-506
in Picea abies ( L). Karst, and its possible role in lyses in determination of damage degree of com


the "Fichtensterben". European Journal of Forest mon oak forests. Radovi 29( 1), 151 -160.


Pathology 16,408-423. Zoldoš, V., Besendorfer, V., Littvay, T., PaSchlegel,
R., Craig, R.N. 1991: Mitosis: Normal pes, D. 1994b: The common oak (Quercus rocontrol
mechanisms and consequences of aber-bur L.) as potential test plant for cytotoxicyti
rant regulation in mammalian cells. U: Perspe- monitoring. Periodicum Biologorum 96 (4),
ctives on cellular regulation: From bacteria to 490-492.
cancer (J. Campsi, D.D. Cunmngam, M. Riley Zoldoš, V., Besendorfer, V ., Jelenić, S., Loreds),
wiley-liss, inc., New York, 253-249. ko v i Ć, Z., Littvay, T., Pape š, D. 1997: Cy-


Thijsse G.,Baas,P. 1990: "Natural" and NH3 indu- togenetic damages as an indicator of pedunculate


ced variation in epicuticular needle wax mor- oak forest decline. U: Borzan, Ž. Schlarbaum,


phology of Pseudotsuga menziessi. Trees: Struc- S.E. (ed.), Cytogenetic Studies of Forest Trees


ture and Function 4, 111-119. and Skrub Species. Proc. First IUFRO Cytoge-
Zoldoš, V, Li ttvay,T, Besendorfer, V., Jele - netics Working Party S2.04-08 Symposium, Brinić,
S.,Lorković,Z.,Papeš,D. 1994a: The juni 8-11, 09.1993.275-284.
application of citogenetic and biochemical ana-


SUMMARY: Decline and decay of pedunculate oak forests (Quercus robur
L.) becomes a more and more important problem of forestry in Croatia. Decay
of forests is obvious near industrial formations and their dumps. The effect of
phosphogypsum and waste waters of fertiliser factories in Kutina on pedunculate
oak forests which are located near these factories is examined in this elaboration.


The chemical analysis of the water from the dumps has proved the presence
of heavy metals (AI, Cd and others), as well as a remarkable low pH value of
1,2-2,6. The pedunculate oak growing in the surrounding of the dump showed
60-70% of the crown damage and therefore belongs to the category of highly
damaged trees.


As a first step in our investigation we applied a short-term cytotoxicity-test.
Root-tip meristematic cells were treated by different dilution rates (from 0,5%
to 10%>) of phosphogypsum from the dump. Roots were excised from the
sprouts germinated in laboratory from the acorns gathered in the tree seed
stand.


Mitotic activity decreased with an increase of concentration, except for the
concentration of 2,5% where the opposite effect was noticed. All concentrations
caused the same cytotoxic effect e. i. mitotic aberrations such as c-mitosis
and lagging chromosomes appeared as a result of the spindle disturbances.
The most frequent were subchromatide aberrations such as sticking of the
chromosomes.


There was no significant change of the mitotic activity after a 24-hour recovery
for any of the concentrations. Mitotic activity remained low and even
higher rate of the subchromatide aberrations were noticed.


Allium-test was applied as a control test of the cyto- and genotoxicity of the
phosphogypsum from the dumps. Bulbs of the onion Allium ascalonicum were
germinated in the tap water and treated subsequently with the same dilutions
of phosphogypsum that were used in cytotoxicity test with roots of pedunculate
oak. As a negative control we used onions germinated in tap water while
onions treated with maleichydrazide served as a positive control.


Allium-test confirmed cyto- and genotoxicity of phospogypsum from the
dumps. Important inhibition of the roots´ growth after a five-days-treatment




ŠUMARSKI LIST 11-12/1998 str. 20     <-- 20 -->        PDF

.1. Rosa: UTJECAJ FOSFOGIPSA IZ INDUSTRIJSKOG ODLAGALIŠTA NA HRAST LUŽNJAK (Qtieirus mhur) Šumarski lisl hr. 11-12. CXX1I (1998), 491-506


with the all concentrations was noticed. Although mitotic activity was hardly
lowered, a high number of the chromosomal aberrations was noticed of which
chromosome breaks were the most frequent ones. The most frequent mitotic
aberrations were c-mitosis and vagrant chromosomes.


In order to establish the immediate influence of phosphogypsum dumps on
cytogenetic changes of pedunculate oak we analysed root-tip cells of the
seedlings germinated from acorns which were collected from trees growing
close to the dump. Seedlings germinated from acorns collected in the seedling
stand served as negative control. No significant difference of the mitotic activity
between the germs near the dump and germs from the seedling stand was
noticed. On the other hand, the germs near the dump showed twice higher rate
of aberrations. Two types of chromosome aberrations; sticking and anaphase
bridges, and three types of mitotic aberrations; multipolar spindle, c-mitosis
and vagrant chromosomes, were noticed


Apart from the cytogenetic analyses of pedunculate oak, fluoride quantity
in the leafs of the trees growing close to phosphogypsum dumps as well as
trees from the seedling stand (control) was established. As increased quantity
of fluoride in the leaves of the oaks near the dump was noticed, we analysed
morphology of the epicuticular wax in leafs of the different development
stages using an electrone-scanning microscope. The analysis revealed the
connection between fluoride quantity in the leaves of pedunculate oak and the
degree of epicuticular wax degradation. In other words, the early degradation
(so called crust) of epicuticular wax on the stomata in the leaves of oaks close
to the dump was recorded, while in the control leaves the same was not observed.
Our research revealed the effect-complexity of the phosphogypsum
dump on the vitality and the reproductive capacity of pedunculate oak.