DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 35 <-- 35 --> PDF |
IZVORNI ZNANSTVENI ČLANCI — ORIGINAL SCIENTIFIC PAPERS UDK630* 165.42.001 (Picea omorica Pane.) Šumarski list br. 3—4. CXX (1996). 121—131 STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA NA PRIMJERU PICEA OMORICA RESEARCH ON THE STANDARDIZATION OF GYMNOSPERM KARYOTYPES USING PICEA OMORICA AS AN EXAMPLE Želimir BORZAN*, Marilena IDŽOJTIĆ* i Helmut GUTTENBERGER** SAŽETAK: Izrađen je kariotip iz endosperma u razvoju jednog stabla Pančićeve omorike, Picea omorica (PANČ.) PURK. Deset kromosoma (n=12) je metacentrično, a kromosomi IX i XII su submetacentrični. Po položaju centromere, kromosomi X i XI su po izgledu skoro submetacentrični, ali su po definiciji klasificirani kao metacenrični. Ipak, na temelju ranijih radova, neki bi autori četiri najmanja kromosoma klasificirali kao submetacentrične. Takva različita stajališta česta su u definiranjima kariotipova iste vrste i problematična kod usporedbi rezultata sličnih citoloških istraživanja. Na temelju iskustava brojnih autora koji su istraživali kariotipove golosjemenjača, predložena je standardizacija u njihovoj izradi, prikazana na primjeru izrade kariotipa Pančičeve omorike. Prikazane su prednosti i nedostatci u analizi metafaznih i anafaznih stanica, prezentaciji numeričkog kariotipa s apsolutnim i relativnim vrijednostima, različitim definicijama položaja centromere, grafičkim prikazima rezultata i vjerodostojnosti zaključaka glede opaženog broja i položaja sekundarnih konstrikcija. Ključne riječi: Picea omorica (PANČ.) PURK, ženski gametofit, kariotip, golosjemenjače, položaj centromere, Feulgen squash metoda UVOD — Introduction Dugogodišnji rad na citološkim istraživanjima bozorske rokove koji najčešće obvezuju istraživača, teško rova i analiza citološke literature gimnosperma, ukazaje u već poodmaklim istraživanjima mijenjati uhodanu li su nam na brojne poteškoće s kojima se susreće svatehniku i započeti s nekim novim pristupom. Rezultat ki citogenetičar, posebice početnik. U istraživanjima je toga može biti izvrstan originalni rad, ali vrlo često idealna situacija kada je istraživač upoznat s postojeobjavljeni rad bude izvor terminoloških nepoznanica ćom literaturom iz užeg područja kojim se kani baviti. (novouvedenih termina za već postojeće) ili se u njeNa žalost, to najčešće nije slučaj, te se radovi drugih mu prikazuju rezultati istraživanja koji nisu komparaautora, ranije objavljivani, a vezani uz istraživanja na bilni s rezultatima istraživanjima ranijih autora. kojima se trenutno radi, nabavljaju sukcesivno, kako rad Primjeri koji potvrđuju takvo gledište bit će iznesena istraživanjima odmiče. Dogodi se, da se u poodma ni u ovom radu, uz prijedlog za standardizaciju materiklim istraživanjima zaključi kako bi bilo bolje da se u jala i metoda istraživanja u kariotipizaciji golosjemeistraživanja krenulo primjenom druge metode rada ili njača, posebice vrsta iz porodice Pinaceae. Rad se teupotrebom nekog drugog materijala. S obzirom na spon melji na vlastitim istraživanjima kariotipa Picea omo * Prof. dr. se. Želimir Borzan, dipl. ing. Marilena Idžojtić, Šumarski rica (PANČ.) Purk. uz iznošenje mogućih načina prifakultet Sveučilišta u Zagrebu; kazivanja rezultata, prema autorima koji su te načine ** Prof. dr. Helmut Guttenberger, Institut fiir Pflanzenphysiologie, KarlFranzens- Universitat Graz, Osterreich koristili u svojim radovima. |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 36 <-- 36 --> PDF |
1. Boraan, M. Idzojtić. H. Gultcnbcrgcr: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA . Šumarski list br. .1—4. CXX (1996). 121 — 131 MATERIJAL I METODE ISTRAŽIVANJA — Material and methods Češerići za istraživanje kariotipa iz haploidnog tkilo. Mjerene su apsolutne dužine krakova svih kromova endosperma u razvoju (= makrogametofit, ženski ga-soma izravno na ekranu računala, primjenom odgovametof´it) sakupljeni su 7. lipnja 1976. s jednog stabla rajućeg programskog paketa. Morfometrijske vrijednosti Pančićeve omorike (Picea omorica (PANČ.) PURK.) statistički su obrađene Excel programom. Izrađen je idiiz vrta Zavoda za šumarsku genetiku i dendrologiju Šuogram, temeljen na relativnim dužinama i morfologiji, marskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Trajni prepau kojem su kromosomi obilježeni rastućim nizom brorati izrađeni su metodom opisanom u ranijim radovima jeva od I do XII, s tim da je I najduži, a XII najkraći (Borzan , 1977, 1981, 1988) modificiranom, klasičkromosom. Detaljniji opis primijenjene metodike i uponom Feulgenovom squash metodom bojenja praparata. trebljene opreme opisan je u radu K 6 h 1 e r et al., 1995. Među tim 18 godina starim trajnim preparatima, odaKariotip istraživanog stabla prikazan je numerički i brana su četiri, s 27 stanica s dobro raspoređenim krografički, a u diskusiji se osvrćemo na različite moguće mosomima. Stanice su digitalizirane te analizirane, korinačine prikazivanja istih rezultata. Konačno, donosimo steći opremu koja se sastojala od videokamere na svjeprijedlog za standardizaciju u istraživanjima kariotipa tlosnom mikroskopu, priključene za središnje računavrsta porodice Pinaceae. REZULTATI ISTRAŽIVANJA — Results Stanica sa dobro raspoređenim i identificiranim me- tacentrični. Držeći se strogo definicije submetacentričtafaznim kromosomima prikazana je na slici 1. Nume- nosti kromosoma prema Saylor u (1961, 1964), sarički kariotip prikazan je u tablicama 1 i 4, a izrađeni mo su kromosomi IX i XII submetacentrični, međutim, idiogram na slici 2. Većina kromosoma (n = 12) su me- kromosomi X i XI su toliko blizu granične vrijednosti Numerički kariotip Pančićeve omorike {Picea omorica (Panč.) Purk.) Numerical karyotype of the Picea omorica (Panč.) Purk.) Tablica 1. Broj kromosoma I n 111 IV V VI vn vm LX x xi xn Chromosome Number Ukupna dužina Total Length 12355 11586 110.37 10799 10599 103.63 101.41 99.03 95.78 9165 77.03 67.71 X Razlika u dužini 769 5 48 238 2 01 2 36 2 22 2 39 3 24 4.14 14.6 932 Length Differences s 4.47 37 8 2.95 2.21 2.01 2.59 2.49 2.14 2.34 35 9 53 5 3-74 C.V. % 362 326 2.67 2.04 1.89 2.49 2.45 2.16 2.44 392 695 553 Kratki krak Short Arm (S) 57.06 53.27 4978 48.12 4835 46.65 45.85 44.33 38.76 3915 3349 25.99 X s 4.48 3.92 5.00 4.94 4.73 3.57 4.64 39 4 5.65 5.27 43 6 4.96 C.V. % 7.85 7.36 10.04 10.26 979 7.66 10.12 8.88 1457 1347 1300 1907 Dugi krak Long Arm (L) 66.48 62.70 60.59 5988 5764 56.99 55.57 54.70 57.02 52.50 4353 41.72 X s 2.96 4.86 5.05 520 516 3.54 4.50 4.04 6.10 5.10 356 5 09 C.V. % 4.45 7.75 8.33 8.69 8.95 6.22 8.09 7.38 10.70 9.72 8.18 12.19 Omjer krakova 0.86 0.86 0.83 0.82 0.85 0.82 0.83 0.82 0.70 0.76 0.77 0.64 Arm Ratio (S/L) Centromerni indeks 46.15 45.96 45.10 44.56 4564 45.01 45.20 44.77 40.49 42.69 4341 38.35 Centromere Index Položaj centromere m m m m m m m m sm m m sm Chromosome Designation Sekundarne konstrikcije 5 ieconda ry Constrictions Položaj na kraku Position on Arms III L 47 VL47 IXL42 XS61 |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 37 <-- 37 --> PDF |
Z. Boran, M. ldžojlić, H. Guttcnberger: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA . Šumarski list br. 3—4, CXX (19961. 121 — 131 omjera krakova S/L = 0.75, da bi se kariotip mogao definirati sa četiri najmanja kromosoma (IX, X, XI i XII) kao submetacentričnima. Slične rezultate u analizi kariotipa Pančićeve omorike dobio je H izum e (1988). Sekundarne konstrikcije nalaze se na dugim krakovima kromosoma III, V i IX, te na kratkom kraku kro mosoma X. Prema njihovoj udaljenosti od centromere, sekundarne konstrikcije na dugim krakovima su medijalne, a konstrikcija na kratkom kraku kromosoma X je smještena više terminalno. U preparatima je opaženo "sljepljivanje" (stickiness) nehomolognih kromosoma. DISKUSIJA — Discussion a) Izbor materijala za istraživanje: diploidni meristem korjenčića ili haploidni endosperm? - Research material option: rot tip meristem versus female gametophyte tissue? Uobičajeni način istraživanja kariotipa je analiza metafaznih kromosoma u diploidnim stanicama meristema korjenčića. I golosjemenjače su se, sve do rada Sax & S a x (1933), istraživale na temelju analize preparata radenih iz meristema korjenčića. Sax i Sax su 1933. prvi ukazali na prednosti u korištenju haploidnog endosperma u citološkim istraživanjima golosjemenjača. Analizirali su 53 vrste, svrstane u 16 rodova. Nakon toga rada, tek je mali broj istraživača koristio en SI. 1. Metafaza u endospermu Pančićeve omorike s identificiranim kromosomima. Fig. 1 Metaphase plate from the female gametophyte tissue of Picea omorica (PANČ.) PURK. tree. All chromosomes are identified. dosperm. Među njima treba spomenuti radove Santa moura (1960), Sarkara (1963) Merge naBurley a (1964), 111 i e s (1971). Osobitu pozornost zaslužuje rad P e d e r i c k a (1967, 1969, 1970), koji je prikazivao detaljnu morfologiju kromosoma u endospermu borova i sigurno bio poticaj drugim istraživačima kariotipova četinjača u pokušajima korištenja njegove metode za rješavanje različitih citoloških problema. Medu te radove možemo ubrojiti radove: B o r z a n (1977, 1981, 1988), Borzan & Papeš (1978) i MacPherson & Filion (1981). Nabrajajući prednosti upotrebe endosperma golosjemenjača za ciološka istraživanja, svakako na prvom Picea omorika I´icea omorika t > : t « x i a \ B i Picea omorika SI. 2. Idiograin istraživanog stabla Pančićeve omorike prikazan prema trima različitim metodama: a) prema Borzanu (1988). h) prema Sayloru (1961) i c) prema Guttenbergeru (1933). Fig. 2 ldiograms of the same Picea omorica (PANČ.) PURK. tree constructed after three different methods: a) after Borzan (1988), b) after Saylor (1961) and c) after Guttenberger (1933). |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 38 <-- 38 --> PDF |
Ž. Borzan, M. Idžojtić, H. Guttenberger: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA . Šumarski list br. 3—i, CXX (1996). 121—131 Broj i postotak submetacentričnih kromosoma u uzorku od 126 stanica četiriju različitih vrsta borova. Od sedam različitih stabala analizirano je po 18 stanica Number and percent of submetacentric chromosomes in 18-cell samples of 7 different trees of four pine species and out of a total of 126 cells Tablica 2. Oznaka analiziranog stabla Designation of the Analysed Tree Kromoso m br. Chromosom e No. i n 47 ui 22 1 ni 366 sy 367 «y 77 deVll 6 nisy 410 Ukupn o Total n % a % n % n % n % n % n % n % I 3 16.67 1 5.56 1 55 6 0 0.00 2 11.11 1 55 6 0 0.00 8 6.35 n in 1 3 5.56 16.67 0 0 0.00 0.00 0 1 0.00 55 6 0 1 0.00 55 6 1 0 5.56 0.00 0 0 0.00 0.00 1 2 5.56 11.11 3 7 23 8 5.56 IV 0 0.00 0 0.00 3 16.67 0 0.00 0 0.00 1 55 6 1 5.56 5 3-97 V 2 11.11 1 5.56 1 5.56 1 5.56 1 5.56 0 0.00 0 0.00 6 4.76 VI 3 16.67 0 0.00 1 5.56 2 11.11 0 0.00 0 0.00 0 0.00 6 4.76 vn 1 5.56 0 0.00 2 11.11 2 11.11 1 5.56 0 0.00 2 11.11 8 6.35 vm rx 2 0 11.11 0.00 1 3 55 6 16.67 2 1 11.11 5.56 3 1 16.67 55 6 1 2 5.56 11.11 1 1 55 6 55 6 2 1 11.11 55 6 12 9 95 2 7.14 X 1 11.11 5 27.78 6 33.33 1 55 6 2 11.11 4 22.22 1 5.56 20 15.87 XI 12 66.67 10 55.56 11 61.11 12 66.67 10 55.56 9 50.00 2 11.11 66 52.38 xn 17 94.44 17 94.44, 16 88.89 12 66 67 16 88.89 10 555 6 15 83.33 103 81.75 mjestu treba spomenuti haploidno stanje tkiva. Jednostavnija je i izrada preparata, s manjim brojem agresivnih kemikalija. Kromosomi u stanicama endosperma u razvoju pokazuju više morfoloških detalja, osobito u pogledu sekundarnih konstrikcija, ali i manje variraju od stanice do stanice. Tome je, vjerojatno, razlog što stanice endosperma pretstavljaju genom stabla, a stanice meristema korjenčića mogu biti kompleksnije, ovisno o mogućim različitim roditeljskim parovima u formiranju sjemena, tj. svaki preparat napravljen iz jednog korr^ s? ^ IO pm 6 SI. 3. Anafaza u endospermu običnog bora (Pinus sylvestris L.). Kromatide br. IX imaju očigledno različite dužine. Iz rada Borzana (1988) Fig. 3 Scots pine (Pinus sylvestris L.) anaphase cell. Chromatids No. IX have obvious different morphometric values. Reproduced from Borzan (1988) jenčića može s drugim preparatom imati sigurno zajedničkog samo jednog (ženskog) roditelja, ako sjeme potječe s istog stabla. Teoretski, dva preparata od kojih je svaki izrađen iz druge sjemenke, mogu pretstavljati dva različita genoma. S obzirom da se kod izrade preparata iz tkiva endosperma ne koristi predtretiranje radi kontrahiranja kromosoma, variranje njihovih relativnih dužina je veće. Ukratko, u meristemu korjenčića može se vidjeti manje morfoloških karakteristika kromosoma, pa su i rezultati istraživanja "siromašniji". Jedina "zamjerka" endospermu jest kratko vrijeme (oko dva tjedna tijekom vegetacije) kada se materijal može prikupljati za citološka istraživanja. b) Izbor tehnike bojenja - Different staining techniques Različite tehnike bojenja mogu se vrlo uspješno primijeniti na stanice u diobi endosperma u razvoju. Osobito prikladnom pokazala se mogućnost primjene Giemsa C - banding metode na ovo tkivo, na što ukazuju radovi: B orzan & Papeš (1978), Tanaka & H izu me (1980), MacPherson & Filion (1981), Borzan (1981, 1988) i rad Kohler et al. (1995). Preostaje još da se primjene druge metode diferencijalnog bojenja kromosoma, uspješno primijenjenih na meristeme korjenčića, kao npr. u radu Schlarbaum & Ts uc hi y a (1981), koji su pruganje kromosoma izazvali niskim temperaturama tijekom predtretiranja. Osobito obećavajućima, čine se metode koje su primijenjene u radovima K o n d o & Hizume (1982), Hi z u me et al. (1983)iKondo et al. (1985), u kojima su se koristile fluorescentne boje |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 39 <-- 39 --> PDF |
Ž. Borzan, M. IcJ/.ojtić, H. Gutlcnberger: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA ... Šumarski list br. 3—4, CXX (1996), 121 — 131 c) Diobeni stadiji, analiza slika i broj analiziranih stanica - Division phases, image analyses and the number of investigated cells Neke od prednosti, koje, za kariološku analizu pruža tkivo endosperma u razvoju, mogu se jasno vidjeti na slici 3. Slika prikazuje anafazu običnog bora (Borzan , 1988) na kojoj se mogu pojedine kromatide pridružiti i identificirati kao par koji je bio združen u odgovarajući kromosom. Izmjera dužina pojedinih kromatida pokazala je, međutim, da se nakon razdvajanja pojedine kromatide koje pripadaju istom paru, mogu znatno razlikovati po svojim ukupnim dužinama. To je i razlog da se na sljedećoj slici (slika 4), koja prikazuje anafazu analiziranog stabla Pančićeve omorike, ne može tako jasno, kao na prethodnoj slici, pridružiti sve kromatide u odgovarajuće parove. Pokušali smo to učiniti na temelju pojavljivanja sekundarnih konstrikcija i na temelju izmjere dužina kromatida, rangiranjem pa SI. 4. Anafaza u endospermu Pančićeve omorike. U ovom slučaju nije bilo rova u niz od I - XII. Radeći tako, ustanovili smo da se moguće sa sigurnošću identificirati sve kromatide. u ovom slučaju javlja isti problem kao i kod analize neke Fig. 4 Picea omorica (PANČ.) PURK. anaphase cell. It was not possible to identify chromatids with certainty. diploidne metafaze iz meristema korjenčića. Jedina razlika je bila u tome što se na ovoj anafaznoj slici jasno vidjelo da se pojedine kromatide po svojoj dužini ne može združiti u par, što se u diploidnim stanicama ne fazama iz meristema korjenčića, gdje je moguće zdrumože vidjeti. Kod anafazne stanice dodatna pomoć u živanje kromosoma u parove prema ukupnoj dužini krozdruživanju parova može biti orijentacija kromatida premosoma i eventualno položaju centromere, odnosno poma suprotnom polu. Na anafazi (slika 4) nije vidljiva ložaju sekundarne konstrikcije. Združivanjem kromajasna orijentacija svih kromatida na dva suprotna pola, tida u parove samo prema dužini u ovoj anafaznoj stapa je u tom pogledu ta stanica slična diploidnim meta-nici, dešavalo se, da su u parove združene kromatide Različiti rezultati dobiveni u položaju centromere kromosoma Pančićeve omorike (metacentričan, submetacentričan ili metasubmetacentričan), ovisno o upotrebljenoj klasifikaciji prema SAYLORU (1961), LEV ANU et al. (1964) ili SCHLARBAUMU & TSUCHIYI (1984) Differences in the centromeric positions of three presentations of Picea omorica chromosomes (metacentric, submetacentric or metasubmetacentric) depending on the classification used after SAYLOR 1961, after LEVAN et al. 1964 and after SCHLARBAUM and TSUCHIYA 1984. Tablica 3. Po definiciji - According Kromosom br. Chromosome No. Po definiciji - According to Definition of SAYLOR (1961) Po definiciji - According to Definition of LEVAN et al. (1964) to Definition of SCHLARBAUM & TSUCHIYA (1984) I m m m n m m m mIV m m m m m m V m m m VI m m m vn Vffl m m m m m m IX sm m msm X m m msm XI m m m xn sm m msm |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 40 <-- 40 --> PDF |
Ž. Borzan, M. Idžojtić, H. Guttenberger: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARI0T1P0VA ČETINJAČA . Šumarski list br. 3—4, CXX (1996), 121—131 koje po svom obliku, orijentaciji, mjestu gdje su pričvršćene niti diobenog vretena ili po položaju sekundarne konstrikcije, ne bi smjele biti združene u par. Niti na temelju usvajanja drugih kriterija (položaj sekundarnih konstrikcija, položaj centromere) nismo uspjeli identificirati parove kromatida te anafazne stanice. Zaključujemo, da se u izradi kariotipa diploidnih metafaza meristema korjenčića zapravo nasilno združuju u parove kromosomi koji ne pripadaju istom paru, što je na ovom primjeru anafazne stanice više nego očito. Stoga i S i m a k (1966) idiograme kojima se prikazuje rezultat kariološke analize smatra samo vjerojatnim prikazom i naziva ih "prividnim" (apparent idiogram). Upotreba računalne opreme u istraživanjima daje novi kvalitetni iskorak u analizi kariotipa, jer se preparati mogu snimiti na tvrdi disk, bez potrebe za izradom trajnih preparata. Snimci se mogu spremiti i čuvati na različitim magnetnim medijima i kasnije obrađivati po potrebi. Ubrzanje u analizi i radu koje pruža računalo, omogućava obradu velikog broja podataka za vrlo krat ko vrijeme. Velik je napredak postignut u razradi tzv. expertnog sistema, temeljenog na prepoznavanju određenih karakteristika kromosoma (Guttenberge r et al., 1995). Sigurno je da danas moderni laboratoriji više i ne mogu zamisliti rad na citološkim istraživanjima bez obrade uz pomoć računala. d) Varijabilnost kariotipova - Karyotype variability U istraživanju kariotipa neke vrste, jedan od glavnih ciljeva je odgovoriti na pitanje o mogućoj unutarvrsnoj varijabilnosti kariotipova: Da li postoji unutarvrsna varijabilnost kariotipova? Da bi točno odgovorili na to pitanje, još uvijek nemamo dovoljno parametara za točnu identifikaciju kromosoma. To znači da intraspecifična varijabilnost u radovima u kojima nije pronađen neki specifičan marker poput B-kromosoma, koji bi neku populaciju ili provenijenciju s takvim markerom izdvojio od ostalih populacija ili provenijencija, ne dolazi do izražaja. Stoga su Numerički kariotip analiziranog stabla Pančićeve omorike. Ukupne dužine kromosoma Numerical karyotype of the analysed Picea omorica (PANC.) PURK. tree. Chromosome lengths Kromosom br. Chromosome No. I II m IV V VI vn vra IX X XI xn Razlike između susjednih kromosoma Differences Between Neighbouring Chromosomes 7.69208717 548357909 2.37867506 2.00555188 2.35602264 2.21798163 2.38663403 3.24495158 4.13622902 14.6199595 9.31449107 Srednja relativna dužina Relative Mean Lengths (S+L) X 123.5481 115.856 110.3724 107.9938 105.9882 103.6322 101.4142 99.02758 9578263 916464 77.02644 67.71195 Standardna devijacija Standard Deviations s 4.466597 3.781672 2.947787 2.205168 2.005308 2.585574 2.486175 2.135006 2.338546 3.588389 5353526 3743811 Tablica 4a. c.v. % 362 326 2.67 2.04 1.89 2.49 2.45 2.16 2.44 392 6.95 553 |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 41 <-- 41 --> PDF |
Ž. Borean, M. Idžojtic, H. Gultenberger: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA . Šumarski list br. 3—4, CXX (1996), 121—131 Numerički kariotip analiziranog stabla Pančićeve omorike. Dužine kromosomskih krakova Numerical karyotype of the analysed Picea omorica (PANč.) PURK. tree. Chromosome arm lengths Tablica 4b. Kromosom br. Chromosome No. I n m IV V VI vn vra IX X XI xn Kratki krak - Short Arms (S) Dugi krak - Long Arms (L) s X 57.06325 4.479643 5327163 3.920674 49.78405 4.997463 48.11511 4.935561 48.35208 4.732728 46.64559 3572534 45.84552 4.64033 44.32829 3.938377 38.75945 564551 39.14555 5.27417 334921 4.35551 2599246 4.95762 i rezultati istraživanja unutarvrsne varijabilnosti kariotipova za vrste porodice Pinaceae zaključivani zaključkom da razlika unutar vrsta nema, te da su i razlike između pojedinih vrsta nekoga roda vrlo malene ili da ih uopće nema. Razlog koji dovodi do takvog zaključka je prvenstveno zamjena u redoslijedu kromosoma (M a t e r n & S i m a k , 1968), osobito onih koji su slični po svojoj ukupnoj dužini i položaju centromere. Uslijed toga, razlike medu njima bivaju maskirane, te redovito dolazi do izjednačavanja vrijednosti (uprosječivanja) kojima se eventualno postojeće razlike u morfometriji kromosoma unutar vrste prikrivaju. C.V. % X s C.V. % 7.85 66.48486 2.960115 4.45 7.36 62.7012 4.861042 7.75 10.04 60.5884 5.047345 8.33 10.26 5987866 5.20127 8.69 979 57.63614 5160655 8.95 7.66 56.9866 3.544545 6.22 10.12 555687 4.497435 8.09 8.88 54.69929 4.038272 7.38 14.57 57.02318 6.103014 10.70 13.47 52.50085 5101821 972 1300 43.53434 3559989 8.18 1907 41.71949 5.08747 12.19 Da bismo to pojasnili, moramo istaći činjenicu koje smo zapravo svi svjesni, ali ju u analizi kariotipa rijetko uzimamo u obzir. Naime, kod analize svake metafazne slike pretpostavlja se da su kromosomi fiksni, kako po svojoj dužini, tako i u svojim međusobnim odnosima. Pretpostavljamo dakle, daje npr. kromosom III UVIJEK duži od kromosoma IV - XII, odnosno da je kromosom IV UVIJEK kraći od kromosoma I - III. Radeći tako, zaboravljamo činjenicu da se tijekom diobe kromosomi ponašaju kao individualna tjelešca koja se ispružaju (istežu), skupljaju (kontrahiraju), savijaju, te stoga u trenutku fiksiranja i prepariranja imaju zamrznut izgled stanja svoje trenutne fiziološke aktivnosti. U ta Numerički kariotip analiziranog stabla Pančićeve omorike. Omjeri krakova, centromerni indeksi i definicija kromosoma prema položaju centromere Numerical karyotype of the analysed Picea omorica (PANC.) PURK. tree. Chromosome arm ratios, centromere indices and chromosome designations Omjeri krakova - Arm Ratios Centromerni indeksi - Centromere Kromosom br. (S/L) Indices (S*100/S+L) Chromosome No. X s C.V.% X s C.V.% I 0.860885 0.085462 993 46.14516 2.551548 553 II 0.857528 0.111301 12.98 4596171 3400203 7.40 m 0.832169 0.134821 16.20 45.10208 4.330696 960 IV 0.815494 0.141273 17.32 44.56327 4.582299 10.28 V 0.850781 0.136494 16.04 45.63706 4.511798 989 VI 0.824449 0.104284 12.65 4500626 3.201312 7.11 vn 0.834456 0.124751 14.95 45.19706 4.313331 9.54 Vffl 0.818899 0.120838 14.76 44.7655 3.868671 8.64 IX 0.697503 0.170934 24.51 40.48986 5.981498 14.77 X 0.758908 0.152934 20.15 42.69211 5.259123 12.32 XI 0.774891 0.116494 1503 4340522 3.872479 8.92 xn 0.642982 0.188903 2938 38.35276 6.829564 17.81 Tablica 4c. Chromosome Designation m . m m m m m m m sm m m sm |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 42 <-- 42 --> PDF |
Ž. Borzan, M. Id/ojlic, II. Gimenberger: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA ... Šumarski lisl br. 3—4, CXX (1996), 121—131 kvom stanju, stoga, neki, npr. kromosom III, može biti duži od kromosoma II ili kraći od kromosoma IV. Isto to se odnosi i na krakove svakog kromosoma. Krakovi se također mogu istezati ili skupljati kod istog kromosoma tako da npr. istezanje kraćeg kraka kod metacentričnih kromosoma rezultira u analizi kariotipa njegovim svrstavanjem u duži krak, ili kontrakcija dužeg kraka rezultira njegovim svrstavanjem u kraći krak. Na taj način neki metacentrični kromosom može često biti svrstan među submetacentrične i obratno. Takav je primjer prikazan u radu Borzan a (1988), koji je analizirao broj i postotatk submetacenričnih kromosoma u uzorku od 18 analiziranih stanica svakog od sedam različitih stabala četiriju vrsta borova, odnosno ukupno 126 stanica (tablica 2). Naravno da se to reflektira na nekonzistentnost u registriranju sekundarnih konstrik- Distribucija frekvencija sekundarnih konstrikcija analiziranog stabla Pančićeve omorike. Ubilježene su na kraku kromosoma na kojem su se najčešće nalazile kao prosijek pojavljivanja i dobile oznake: III L 47, VL47, IX L 42 and XS 61. Frequency distribution of secondary constrictions in the analyzed Picea omorica (PANC.) PURK. tree. Secondary constrictions were placed on the arm of a chromosome on which they most often appear, as an average result of their distribution of frequencies and defined as: III L 47, VL47, IX L 42 and XS 61. Tablica 5. KROMOSOM BR. - CHROMOSOME NO. I u Ill IV V VI VII VIII IX X XI XII Distribucija ferkvcuclja sekundarnih konstrikcija * Frequency Distribution or Secondary Constrictions 100 90 SO I I 1 II II 1 70 I I I 1 II III 60 II II 1 1 1 II II III 50 40 II II 1 I I ´ 30 20 1 IO ! .Ci. : ´ >;--; * " * ´ € 10 2 0 30 II II II 1 III 1 III 1 40 1 III II 1 1 II III 50 1 II II III 1 1 1 1 II 1 60 70 III 1 II II 1 II 1 80 90 100 čija. Stoga i autori, poput Saylora (1961) i Yima (1963), napominju u svojim radovima da identifikacija pojedinih kromosoma nije mogla biti provedena na temelju registriranja položaja sekundarnih konstrikcija. Izuzetak je u tom pogledu P e d e r i c k (1967, 1970), koji je upravo po položaju i izgledu sekundarnih i tercijarnih konstrikcija ukazivao na razlike u kariotipu pojedinih vrsta borova. Međutim, usporedbom kariotipova crnog bora publiciranih u radu Pederick a (1970) i S ay 1 or a (1964), sa svojim rezultatima istraživanja, Borza n (1977) nije mogao potvrditi brojnost i položaj konstrikcija koje je objavio P e d e r i c k , niti položaje svih sekundarnih konstrikcija koje je objavio S aylor. Koji su razlozi takvim razlikama u rezultatima istraživanja iste vrste nije moguće spoznati, dok se ne dogovorimo o standardizaciji metoda istraživanja i načina prezentacije rezultata. Tek će se tada dobiti jasnija slika o unutarvrsnoj varijabilnosti. Primjenom standardne metode kariotipizacije različitih stabala neke vrste, koju u različito vrijeme i nezavisno mogu raditi različiti autori, približavamo se saznanju o unutarvrsnoj slici kariotipa te vrste. Time svaki takav rad postaje vrijedan doprinos spoznajama o mogućoj varijabilnosti kariotipova. Pritom moramo istaknuti važnost utvrđivanja unutarvrsnih razlika u kariotipovima, jer bez takvih saznanja nije moguće u cijelosti govoriti o razlikama kariotipova između pojedinih vrsta. e) Poteškoće i dileme kod izrade kariotipa - Difficulties and dilemmas in revealing karyotypes Najveća poteškoća za svakog istraživača je mogućnost ponavljanja rezultata istraživanja nekoga od prethodnih autora. Poteškoća leži u razumijevanju njegovih izbora u načinu obrade podataka i prikazivanja rezultata. Obično to autori čine tako, da se radom nekog prethodnika posluže kao uzorom, a zatim dodaju vlastite modifikacije. Veći broj različitih takvih radova kroz duže razdoblje povećava poteškoće u izboru prikladne metode za rad, ali i za analizu, usporedbe rezultata s drugim istraživanjima te za prikaz vlastitih rezultata istraživanja. Primjeri su za to brojni. Pojedini su autori samo slikom metafazne ploče definirali kariotip istraživane vrste. U takvom je slučaju vlastite rezultate istraživanja teško uspoređivati sa slikom koja je u radu objavljena (i pritom, ponekad, razmišljati o lošoj kvaliteti reprodukcije). Drugi su autori vrlo detaljno opisivali morfološke karakteristike kariotipova pojedinih vrsta, ali nisu naveli broj analiziranih stanica za definiranje tih kariotipova. Stoga se može zaključiti da su analizirali samo jednu stanicu. U tom slučaju nije moguće raspravljati o varijabilnosti unutar vrste, niti varijabilnosti uzorka koji je trebao poslužiti kao podloga za izradu kariotipa. |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 43 <-- 43 --> PDF |
Z. Boran, M. Idžojtić. H. Oullenberger: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA . Šumarski lisl br. 3—4, CXX (1996). 121 — 13] U izboru metode konstrukcije idiograma kromosoljenog na analizi 27 stanica, ali je idiogram prikazan na mi mogu se poredati u niz od najmanjeg prema najve3 različita načina: prema metodi Borzan a (1988), ćem, od najvećeg prema najmanjem, u niz od 1 do 12, Saylora (1961) i Gu t te n berge ra (1995). Iz slina način da od najvećeg prema najmanjemu kromosoke možemo zaključiti daje za očitavanje prikazanih remu osnovni kriterij za redoslijed bude padajući niz duzultata istraživanja s idiograma svakoga od ovih autora žina kratkih krakova ili pak dužina dugih krakova. Nui za uspoređivanje nekog novo izrađenog kariotipa Panmeričke vrijednosti kariotipa ponekad se mogu, ali i ne čićeve omorike potrebno zapravo jedno novo istraživamoraju, naći publicirane u radu. Ako su numeričke vrinje o mogućnosti usporedbe dobivenih rezultata. Sličjednosti publicirane, mogu predstavljati apsolutne vrino, nužno istraživanje, radi mogućnosti usporedbe nejednosti izmjera kromosoma ili pak preračunate, relakih objavljenih i vlastitih rezultata istraživanja uslijetivne vrijednosti dužina kromosoma. Vrlo često objavđuje ako želimo usporediti objavljene numeričke kariljene morfometrijske vrijednosti kojima se definira ka-otipove prikazane u apsolutnim vrijednostima sa vlariotip ne sadrže statističke parametre kojima bi se defistitim rezultatima koje smo izračunali u relativnim vrinirala varijabilnost rezultata i moglo statistički usporejednostima. Poteškoće naročito dolaze do izražaja ako diti rezultate iz literature s vlastitim rezultatima istražisu npr. apsolutne vrijednosti izmjere kontrahiranih krovanja. Određivanje položaja centromere je uobičajeno mosoma diploidnih stanica a relativne vrijednosti izmjeprikazati prema Saylor u (1961), Le v an u et al. ra kromosoma iz stanica endosperma. Tada moramo naj( 1964) ili prema Schlarbaum u & Tsuchiy i prije apsolutne vrijednosti iz nekog objavljenog rada (1984). Sto se dešava ako se isti rezultati tumače prepreračunati u relativne, ali za polovičan broj kromosoma svakome od ovih autora, može se jasno vidjeti iz ma, kako bismo ih usporedili s vlastitim rezultatima istablice 3, jer različiti kriteriji dovode do, najblaže rečetraživanja. no, terminološke zbrke. Nabrajajući ove poteškoće u izboru metode rada u Položaj i pojavljivanje sekundarnih konstrikcija je prikazivanju rezultata citoloških istraživanja (a sigurno također veliki problem, jer se objavljuje njihov položaj je da ih nismo niti sve nabrojali), htjeli smo ukazati na u idiogramu, navodi se kako nisu mogli služiti za idenogroman nepotreban posao kojeg svaki znanstvenik motifikaciju pojedinih kromosoma, a ne objašnjava se, kara uložiti da bi usporedio vlastita istraživanja s već ko se ipak mogao definirati njihov položaj na pojediobjavljenima o istoj vrsti, samo ako se metode prikazinim kromosomima. vanja rezultata razlikuju. To je razlog zašto apeliramo Na slici 2 vide se izgledi idiograma Pančićeve omona jedinstven način rada i prikazivanja rezultata kariorike kao rezultat istraživanja kariotipa te vrste, temeloških istraživanja za vrste porodice Pinaceae. 140 rt 130 1 &><*> i <& c c 120 cR jg o o o V 110 o o 1S o o Vi 100 1° o § 0 d8 ´O. >1 E o 6 ´<** 3 90 > V T3 jdg V u OO U 80 oo°o Oo o O OD1« si ajj rt rt 70 " H u o o ftS tf 60 50 40 H h H r--t r 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 * Submetacentričnost - Submetacentricity Metacentričnost - Metacentricity Centromerni indeks Centromere index SI. 5. Polikariogram analiziranog stabla Pančićeve omorike. Crne točke su srednje vrijednosti. Fig. 5 Polykariogram of the analyzed Picea omorica tree. Filled dots are average values. 129 |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 44 <-- 44 --> PDF |
Ž. Burzan, M. Idžojtič, H. Guuenberger: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA ... Šumarski list br. 3-4 , CXX (1996), 121—131 ZAKLJUČAK - Conclusion Prijedlog standardiziranog načina kariotipizacije vrsta porodice Pinaceae - Proposed standard method of karyotyping species of the Pinaceae family Ako u citološkim istraživanjima nema posebnih razloga zbog kojih su odabrane diploidne stanice (npr. za bioindikacijska istraživanja), za kariološka istraživanja borovki preporuča se koristiti haploidno tkivo endosperma u razvoju. Preparati se mogu raditi kao trajni ili polutrajni. Ako se preparati rade kao polutrajni, obrađene stanice je potrebno sačuvati ili kao fotografiju ili kao snimak načinjen videokamerom montiranom na mikroskop, spremljen na tvrdom disku priključenog računala. Jedini nedostatak u radu s polutrajnim preparatima jest u tome, da se isti preparati ne mogu naknadno pregledavati, kada je znanstvenik, koji ih je ranije pretraživao, postao iskusan citolog. S obzirom da je standardiziranje bojenja preparata jedan od najvećih problema u citologiji, preporuča se primjena bilo koje metode bojenja, koja će za krajnji rezultat imati dobro kontrastirane i obojene kromosome. Kao prihvatljiv vodič svakom istraživaču mogu općenito poslužiti Feulgenova squash metoda bojenja preparata, bojenje acetokarminom, Giemsa - C metoda oprugavanja kromosoma ili neka od fluorescentnih metoda. Vrlo je važan dovoljan broj analiziranih stanica u radu, s ciljem dobivanja najvećeg mogućeg broja pokazatelja u varijabilnosti analiziranog uzorka. Ne preporuča se analizirati manje od osamnaest stanica, a uzorak od trideset analiziranih stanica trebao bi biti dovoljan za dobivanje rezultata koji su statistički dobro dokumentirani. F i t test su jednostavni i dobro ih je koristiti u analizi vlastitih rezultata i za komparaciju s rezultatima istraživanja drugih autora. U raduje nužno objaviti sliku najbolje stanice s dobro raspoređenim kromosomima ili stanice sa značajnim i zanimljivim detaljima o kojima se u radu diskutira. Preporuča se rasporediti kromosome od najdužeg, obilježenog brojem I, do najkraćeg, obilježenog brojem XII. Dužine kromosoma i krakova u stanicama trebaju biti prikazane relativnim vrijednostima u odnosu na dužinu prosječnog kromosoma u svakoj stanici (= 100). Sekundarne konstrikcije treba prikazivati kao postotak udaljenosti od centromere, u odnosu na ukupnu dužinu kraka na kojem se nalaze. U idiogramu ih treba ucrtati na krak kromosoma na kojem su najčešće registrirane, kao prosječan rezultat učestalosti njihovog pojavljivanja. Primjer prikazujemo u tablici 5. Veličinu same sekundarne konstrikcije ne treba uključivati u ukupnu dužinu kraka kromosoma na kojem se nalazi, iako se preporuča u radu posebno registrirati i navesti broj i učestalost prominentnih sekundarnih konstrikcija (jasno neobojenih dijelova krakova kromosoma). Položaj centromere i pripadajuću nomenklaturu kromosoma za vrste porodice Pinaceae treba koristiti prema Saylor u (1961). Prema toj klasifikaciji submetacentrični kromosomi imaju odnos kratki/dugi krak (S/ L) manji od 0.75, dok metacenrični kromosomi imaju veću vrijednost od navedene. Sto se opreme tiče, uputno je koristiti se najboljom raspoloživom opremom. Svakako se preporuča spremanje podataka na računalu, njihova analiza, numerička i grafička prezenacija. U ovom trenutku moderna oprema za citološka istraživanja opisana je u radu Guttenbergera et al. (1995), uz primjenu tzv. ekspertnog sistema, koji se može primijeniti i ako se u citološkim istraživanjima računalo niti ne koristi za analizu. Numerički kariotip treba prikazati kao u ovom radu u tablicama 4a, 4b i 4c. Grafički prikaz karioloških istraživanja idiogramom (slika 2a) je obvezan. Vrlo su informativni i preporučuju se također izraditi tzv. polikariogrami (11 c h e n k o , 1975; Muratova, 1978; B o r z a n , 1988), prikazani u ovom radu na slici 5. Konačno, bit ćemo zahvalni kolegama za svaki komentar na ovaj rad, jer ne smatramo da su preporuke za standardizaciju koje smo ovdje iznijeli bez nedostataka. Ovim radom bila nam je namjera ukazati na nužnost u standardiziranju kariotipizacije vrsta porodice Pinaceae, te se nadamo da ćemo uz pomoć primjedbi koje bi trebale uslijediti, biti u mogućnosti unaprijediti naša istraživanja i time postići bolje rezultate. CITIRANA LITERATURA - References B o r z a n , Ž., 1977: Contribution to the karyotype analysis of the Borzan , Ž. & Pape š , D., 1978: Karyotype analysis in Pinus: European black pine (Pinus nigra Am.). Ann. Forest, vol. A contribution to the standardization of the karyotype anal8( 3), pp. 29-50. ysis and review of some applied techniques. Silvae Geneti- B o r z a n , Ž., 1981: Karyotype analysis from the endosperm of Euca, vol. 27(3-4), pp. 144-150. ropean black pine and Scots pine. Ann. Forest., vol. 10(1), pp. 1-42. Guttenberger , H., 1993: Image analysis and pattern recogniB o r z a n , Ž., 1988: Kariotipovi nekih borova podsekcije Sylves-tion for cytogenetic studies. IUFRO Cytogenetic Working tres. Glasnik za šumske pokuse, Zagreb, vol. 24, pp. 1-100. Party (S2.04-08) Symposium, Brijuni, Croatia. Manuscript, (In Croatian with English summary). pp. 1-12. |
ŠUMARSKI LIST 3-4/1996 str. 45 <-- 45 --> PDF |
Ž. Borzan. M. Idžojtić, H. Gimenberger: STANDARDIZACIJA ISTRAŽIVANJA KARIOTIPOVA ČETINJAČA . Šumarski list br. 3—4, CXX (1996), 121—131 Guttenberger, H., Kohler, B. &Borzan,Z„ 1995: ChroMergen, F. & Bur 1 ey , J., 1964: Abies karyotype analysis. Silmosome banding for identification of the chromosomes of vae Genetica, vol. 13(3), pp. 63-68. Spruce trees. Manuscript. Cytogenetics Working party me eting, IUFRO Congress Tampere, Finland, August 7-13, 1995. Hizume , M., 1988: Karyomorphological studies in the family Pinaceae. Mem. Fac. Educ. Ehime Univ., Nat. Sci., vol. 8, pp. 1-108. Hizume, M., Ohgiku, A.&Tanaka, A., 1983: Chromosome banding in the genus Pinus. I. Identification of chromosomes in Pinus nigra by fluorescent banding method. Bot. Mag. Tokyo, vol. 96, pp. 273-276. 11 c h e n k o , T. P., 1975: Sravnitteljno- kariologicheskoe issledovanie listtvenic primorja. Akademija nauk SSSR, Krasnojarsk. pp. 1-34. lilies , Z. M., 1971: First results on karyological investigations in the endosperm of an aneuploid Larch derived from a C generation of Larix decidua x C0 Larix leptolepis. Ann. Univ. etA.R.E.R.S. vol. 9, pp. 12-15. Kondo, T.&Hizume, M„ 1982: Banding for the chromosomes of Cryptomeria japonica D. Don. J. Jap. For. Soc, vol. 64(9), pp. 356-358. Kondo, T., Hizume, M. &Kubota,R., 1985: Variation of fluorescent chromosome bands of Cryptomeria japonica. J. Jap. For. Soc, vol. 67(5), pp. 184-189. Kohler, B. Guttenberger, H. &Borzan,Ž„ 1995: Karyotype analysis based on female gametophyte of Norway spruce. Forest Genetics, vol. 2(1), pp. 41-48. Levan,A., Fredga K. &Sandberg, A. A., 1964: Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas, vol. 52, pp. 201-220. MacPherson, P. &Filion, W. G. 1981: Karyotype analysis and the distribution of constitutive heterochromatin in five species of Pinus. Hereditas, vol. 72, pp. 193-198. Matern, B. &Simak, M. 1968: Statistical problems in karyotype analysis. Hereditas, vol. 59, pp. 280-288. Muratova , E. N., 1978: Kariotipi kedrovih sosen. I. Kariotip Pinus sibirica Du Tour. Citologija, vol. 20(8), pp. 972-976. Pederick , L. A., 1967: The structure and identification of the chromosomes of Pinus radiata D. Don. Silvae Genetica, vol. 16, pp. 69-77. Pederick , L. A., 1969: The potential of cytogenetic research in Conifer species as indicated by some studies with Pinus radiata. 2nd FAO/IUFRO World Consult. For. Tree Breed., Wash., No FO-FTB-69-8/14, pp. 1-6. Pederick , L. A., 1970: Chromosome relationships between Pinus species. Silvae Genetica, vol. 19, pp. 171-180. Santamour , F. S.Jr.,1960: New chromosome counts in Pinus and Picea. Silvae Genetica, vol. 9, pp. 87-88. Sarkar , P., 1963: Chromosome studies on Pinus species. (Abstract). Canad. J. Genet. Cytol, vol. 5., p. 107. Sax , K.&Sa x H. J., 1933: Chromosome number and morphology in the Conifers. /. Arnold Art., vol. 14, pp. 356-375. Sa y lor , L. C , 1961: A karyotypic analysis of selected species of Pinus. Silvae Genetica 10(3), pp. 77-84. S a y 1 o r, L. C, 1964: Karyotype analysis of Pinus-group Lariciones. Silvae Genetica, vol. 13(6), pp. 165-170. Schlarbaum, S. E. &Tsuchia, T., 1984: The Chromosomes of Cunninghamia konishii, C. lanceolata, and Taiwania cryptomerioides (Taxodiaceae). Plant Systematics and Evolution, vol. 145, pp. 169-181. S i m a k, M., 1966: Karyotype analysis of Larix grijfithiana Carr. Hereditas, vol. 56, pp. 137-141. Tanaka, R.&Hizume M., 1980: C-banding treatment for the chromosomes of some Gymnosperms. Bot. Mag. Tokyo, vol. 93, pp. 167-170. Y i m , K. B., 1963: Karyotype analysis of Pinus rigida. Hereditas, vol. 49, pp. 274-276. SUMMARY: The karyotype analysis of a single Picea omorica (PANČ.) PURK. tree was completed using female gametophyte tissue. Most chromosomes (n=12) were metacentric, but chromosomes IX and XII were submetacentric. The positions of the centromeres of chromosomes X and XI were close to submetacentric, but were classified as metacentric. Some authors, however, could have considered the smallest four chromosomes as submetacentric. This variance among authors in describing karyotypes is problematic when comparisons are made among studies. Based on a review of literature on karyotype analyses of gymnosperms, a standardization for gymnosperm karyotypes is presented. Recommendations for standardization are given including: karyotype analyses using metaphase or anaphase cells, presentations of numerical karyotypes in absolute or relative length, definitions of centromere position, karyotype graphs, and reliability of position and frequency of secondary constrictions. Key words: Picea omorica (PANC.) PURK., Karyotypes, Endosperm in development, Gymnosperms, Centromere nomenclature, Feulgen squash method |