DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1991 str. 25 <-- 25 --> PDF |
IZVORNI ZNANSTVENI ČLANAK - ORIGINAL SCIENTIFIC PAPER UDK 630*232.13.001/2 (Betula sp.) Šum. list CXV (1991) 23 MIKROPROPAGACIJA OBIČNE BREZE (Betula pendula Roth), PAPIRASTE BREZE (B. papyrifera Marsh.) I ŽUTE BREZE (B. lutea Michx.) Višnja BESENDORFER i Branka KOLEVSKA-PLETIKAPIĆ* SAŽETAK: Mikropropagacijski postupak za običnu brezu (Betula pendula Roth.), papirastu brezu (B. papyrifera Marsh.) i žutu brezu (B. lutea Michx.) zasnovan je na primjeni kulture dormantnih aksilarnih pupova za dobivanje izdanaka i regeneraciju kompletnih biljaka. Za indukciju izdanaka iz meristema pupova i njihovo umnažanje korištena je podloga mod. ACM uz dodatak 2,2 \xM BA. Na ovoj podlozi izdanci su umnaženi uspješno kroz dvijegodine. Razlike u stopi umnažanja između tri vrste breza, kao i njihovih pojedinačno ispitivanih genotipova, uvjetovane su posjedovanjem različitog morfogenetskog potencijala, kao i fiziološkim statusom roditeljske biljke. Zakorjenjivanjem izdanaka na podlozi mod. ACM uz dodatak ],0°/o \J.M IBA regenerirane su kompletne biljke koje su se uspješno prilagođavale stakleničkim uvjetima uzgoja, a u rasadniku su izrastale u normalne sadnice. Ključne riječi: mikropropagacija, Betula pendula, B. papyrifera, B. lutea. UVOD Metode kulture biljnog tkiva, sve su prihvaćenije, a time i prisutnije u radu na unapređenju biljne proizvodnje. Iako su mogućnosti njene primjene znatno šire, kultura tkiva u šumarstvu spominje se najčešće kao alternativa za vegetativno razmnožavanje (B a j a j 1986, Bong a i Durza n 1987). U tom pogledu značajne perspektive otvara tehnika razmnožavanja biljaka in vitro, mikropropagacija. Njenom primjenom u šumarstvu postaje moguće vegetativno razmnožavanje mnogih vrsta šumskog drveća koje se klasičnim metodama razmnožavaju teško ili nikako (C h a 1 u p a 1987, M c- Covvn i McCown 1987, Kolevska-Pletikapić, 1985, Kolevska- Pletikapić i Tomović 1988, Pevalek-Kozlina i Jelask a 1986). Osim toga mikrokloniranjem je moguće trajno očuvanje pojedinih jedinki-stabala s prirodnim superiornim karakteristikama (Karnosk y 1981). Primjenom mikropropagacijskih metoda u oplemenjivanju šumskog drveća može se do reproduktivnog sadnog materijala doći znatno brže i u * Mr. Višnja Besendorfer i dr. Branka Kolevska-Pletikapić, Zavod za molekularnu biologiju, Prirodoslovno-matematički fakultet u Zagrebu, Rooseveltov trg 6/III, p.p. 933, 41001 Zagreb |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1991 str. 26 <-- 26 --> PDF |
neograničenim količinama, čime se postavljeni ciljeva postižu u znatno kraćem vremenu. Mikropropagacija listopadnih vrsta šumskog drveća se temelji na korištenju postojećih meristema, najčešće dormantnih aksilarnih pupova, kao materijala za početnu manipulaciju in vitro. U odnosu na druge načine dobivanja biljaka kulturom tkiva, ovoj metodi se u šumarstvu daje prednost, jer je genetički najkonzervativnija. Osim toga ona se odlikuje izuzetnom jednostavnošću i efikasnošću. S ciljem da se razradi mikropropagacijski postupak za breze, u ovom radu je istraživana mogućnost uvođenja u kulturu dormantnih aksilarnih pupova juvenilnih i adultnih roditeljskih biljaka, te umnažanje izdanaka i njihovo zakorjenjivanje in vitro. Odabrane su tri vrste breza i to: obična ili evropska breza (Betula pendula Roth.), papirasta breza (B. papyrifera Marsh.) i žuta breza (B. lutea Michx.). Vrste su odabrane zbog njihove gospodarske važnosti, a i zato što je vegetativno razmnožavanje breza klasičnim metodama otežano (Jovanović i Tucović 1969, Tucović i Jovanović 1970, Krstinić i Kajba, usmeno priopćenje). MATERIJAL I METODE Biljni materijal Dormantni aksilarni pupovi, sabirani sa roditeljskih biljaka od prosinca do ožujka 1987/88. godine, korišteni su kao početni eksplantati. Za rad je odabrano šest roditeljskih biljaka obične breze — dvije dvogodišnje (genotipovi JV1 i JV2), tri četverogodišnje (genotipovi Ml, M3 i M4) i jedna dvadesetogodišnja (genotip SB). Također su odabrane dvije dvogodišnje papiraste breze (genotipovi P2 i P4) i četiri dvogodišnje žute breze (genotipovi LI, L3, L4 i L5). Pupovi su prije izolacije meristema sterilizirani dvostruko i to: u 3%»-tnoj vodenoj otopini klornog preparata »Izosan G« (Pliva, Zagreb) 15 minuta i u 6°/o-tnom vodikovom peroksidu 5 minuta. Nakon svake sterilizacije ispirani su višekratno u sterilnoj destiliranoj vodi. Meristemi pupova s nekoliko mladih primarnih listova izolirani su pod binokularnom lupom u aseptičnim uvjetima i inokulirani na hranidbenu podlogu. U radu su korištene biljke iz rasadnika Šumarskog instituta Jastrebarsko i Šumarskog fakulteta u Zagrebu, te arboretuma Lisičine kraj Podravske Slatine. Hranidbena podloga Za poticanje razvitka izdanaka iz meristema postojećih pupova, te njihovo umnažanje korištena je modificirana podloga ACM (Ahuj a 1983) u kojoj je koncentracija lizina smanjena na polovicu (342 uM), a adenin sulfat je izostavljen iz podloge. Od regulatora rastenja dodavan je samo citokinin 6-benzilaminopurin (BA) i to 2,2 uM (indukcijska podloga). Za zakorjenjivanje izdanaka korišten je isti hranidbeni sastav, a od regulatora rastenja dodano je 1,0 y.M indolil-3-maslačne kiseline (IBA). 24 |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1991 str. 27 <-- 27 --> PDF |
Vanjski uvjeti Kulture su rasle u klima komori na temperaturi 25 ± 1° C uz 16-satno osvjetljavanje umjetnim bijelim svjetlom (fluorescentne lampe TEŽ — Zagreb, 40 W, 400—700 nm, 17 WITT-) UZ intenzitet rasvjete 800—1500 lx. Kompletne biljke su presađivane u supstrat (mješavina treseta, perlita i pijeska). U vrijeme aklimatizacije pokrivane su 8—10 dana staklom zbog zaštite od isušivanja, a nakon toga su rasle u uvjetima uobičajenim za uzgoj sadnica. Razlika u statističkoj vjerojatnosti unutar aritmetičkih sredina pojedinih ispitnih grupa provedena je analizom varijance. REZULTATI Mikropropagacija juvenilnih breza Uspostavljanje kulture Površinskom sterilizacijom dobiveno je 60—80% sterilnih pupova na kojima je zatim ispitana mogućnost indukcije izdanka iz pupova. Na indukcijskoj podlozi (mod. ACM s 2,2 uJVl BA) potaknut je razvitak izdanaka iz meristema aksilarnih pupova sve tri ispitivane vrste breza. On je ovisio o vrsti breze, ali ne i o starosti roditeljske biljke (Tablica 1). Razvitak izdanka potaknut je na najvećem broju pupova papiraste breze, njih 75%, dok se u početnoj kulturi žute breze u izdanke razvilo samo 46% pupova. U početnoj kulturi obične breze u izdanke se razvilo približno isto pupova — 67% porijeklom od dvogodišnjih i 66% od četverogodišnjih roditeljskih biljaka. Tijekom 4-tjedne početne kulture izdanci s normalno razvijenim listovima izduživali su se 2—5 cm u visinu. Tablica !. Razvitak izdanaka u početnoj kulturi na indukcijskoj podlozi, mod. ACM uz dodatak 2,2 |.iM BA Shoot development in primary culture on induction medium supplemented with 2.2 uM BA Starost roditeljskih Tnokulirano Razvijeni izdanci Vrsta biljaka (godine) pupova (br.) (a/o) Species Age of donor plants Inoculated buds Developed shoots (yrs) (No.) (%) 2 24 67,0 Betula pendula 77 66,0 Betula papyrifera 2 11 75,0 Betula lutea 2 22 46,0 Umnažanje izdanaka Izdanci razvijeni u početnoj kulturi umnažani su također na indukcijskoj podlozi. Rezani su na segmente veličine 1 cm s 2—3 nodija kod obične breze, ili s jednim nodijem kod papiraste i žute breze. Ovaj postupak ponavljan je svakih 4—5 tjedana u vremenskom periodu od dvije godine kada |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1991 str. 28 <-- 28 --> PDF |
su praćene morfološke karakteristike kultura i stopa umnažanja svake pojedine vrste i svakog genotipa unutar vrste. Morfološke karakteristike Supkultiviranjem segmenata izdanaka obične breze, na svakom od njih neovisno o starosti roditeljskih biljaka i genotipa, inducirana je proliferacija izdanaka (si. 1). Tako se kroz 5 tjedana u bazi svakog supkultiviranog segmenta razvilo 2—5 novih izdanaka visokih 2—5 cm. Nasuprot tome, kroz isto vrijeme iz svakog supkultiviranog segmenta papiraste i žute breze razvijao se uvijek samo jedan 3—8 cm visoki izdanak (si. 2). Slike 1. i 2. Aksil´arni izdanci vrsta Betula pendula (1) i B. lutea (2) umnoženi na indukcijskoj podlozi (mod. ACM s 2,2 uJVI BA). — Axillary shoots of Betula pendula (1) and B. lutea (2) multiplicated on induction medium (mod. ACM with 2.2uM BA) Stopa umnažanja Nije postojala značajna razlika u stopi umnažanja između vrsta breza i genotipa unutar njih (Grafikon 1). Ipak, najvećom stopom umnažana je obična breza (4,7—6,0), dok je u kulturi žute breze stopa umnažanja bila najmanja (4,1—5,0). Utjecaj genotipa na stopu umnažanja uočen je kod sve tri vrste breza, ali je on kod obične i žute breze bio izraženiji. U kulturi obične breze stopa umnažanja je bila uvjetovana i starošću roditeljske biljke, te je u kulturi genotipova JV1 i JV3 porijeklom od dvogodišnjih biljaka iznosila 6,0 nodijskih segmenata po eksplantatu, a u kulturi genotipova Ml, M3 i M4 porijeklom od četverogodišnjih biljaka 5,0. |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1991 str. 29 <-- 29 --> PDF |
Grafikon 1. Stopa umnažanja obične (JV1. JV3. Ml. M3. M4). papiraste (P2. P4) i žute (LI. L3. L4 L5) breze na podlozi mod. ACM uz dodatak 2,2 uJVl BA. Shoot multiplication of European, paper and yellow birches on mod. ACM medium supplemented with 2.2 |j,M BA JV! JV3 Ml M3 rw P2 P4 L1 13 L4 L5 6EN0TIP GENOTYPE Zakorjenjivanje izdanaka Pojedinačno izolirani izdanci visoki 2—4 cm presađivani su na podlogu za zakorjenjivanje mod. ACM uz dodatak 1,0 \xM IBA. Kroz dva tjedna na izdancima sve tri vrste breza razvio se adventivni korjenov sistem (si. 3). Zakorjenjivanje obične i papiraste breze bilo je u potpunosti uspješno za sve ispitivane genotipove (Tablica 2). Kod žute breze razvitak korjenovog sistema potaknut je u prosjeku na 75,5°/o izdanaka, jer su utvrđene genotipske razlike u uspješnosti zakorjenjivanja izdanaka (Tablica 3). Tablica 2. Regeneracija adventivnog korjenovog sistema na mod. podlozi ACM uz dodatak 1,0 uM IBA Regeneration of adventitious root system on mod. ACM medium supplemented with 1.0 uM IBA Vrsta Bi-oj izdanaka ?/a zakorjenjenih izdanaka Species No. of shoots %] of rooted shoots Betula pendula 290 100,0 Betula papyrifera 90 100,0 Betula lutea 40 75,5 |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1991 str. 30 <-- 30 --> PDF |
Tablica 3. Utjecaj genotipa na zakorjenjivanje izdanaka žute breze na podlozi mod. ACM uz dodatak 1,0 u.M IB A Genotype effect on rooting of shoots in yellow birch Genotip Genotype Bro No. i izdanaka of fhoots °/o zakorj °/o of enjenih izdanaka rooted shoots LI 29 96,5 13 18 78,0 L4 26 54,0 L5 19 74,0 Aklimatizacija Kompletno regenerirane biljke presađivane su u smjesu zemlje, treseta i perlita, kako bi se prilagodile na vanjske uvjete uzgoja. Nakon 2—3 mjeseca uzgoja u stakleniku biljke su prenesene u rasadnik gdje su se razvile u normalne sadnice (si. 4). Slike 3. i 4. Kompletna biljka vrste Betula papyrifera dobivena je regeneraci jom adventivnog korjenovog sistema na hranidbenoj podlozi mod. ACM s 1,0 p.M IBA (3) i aklimatizirane mlade biljke vrste B. pendula regenerirane in vitro koje su nakon uzgoja u stakleniku presađivane u polje (4). — The plantlet of Betula papyrifera were obtained by adventitous root regeneration on mod. ACM medium supplemented with 1.0 iiM IBA (3) and acclimatized plantlets of B. pendula before transfering to a field (4) Mikrokloniranje adultne obične breze Daljnji cilj naših istraživanja bio je ispitali mogućnost primjene opisanog mikropropagacijskog postupka i kod odraslih stabala, posebice vrste Betula pendula koja je rasprostranjena u našim krajevima. Kroz 4—5 tje |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1991 str. 31 <-- 31 --> PDF |
dana iz meristema aksilarnih pupova dvadesetogodišnjeg stabla (genotip SB) inokuliranili na indukcijsku podlogu (mod. ACM s 2,2 u,M BA) potaknut je razvitak izdanka. Međutim, proliferacija izdanaka je postignuta tek nakon tri do četiri supkultiviranja na istu hranidbenu podlogu. Tijekom umnažanja uglavnom se uvijek razvijao veći glavni izdanak, dok su postrani izdanci bili niži i malih listova. Stopa umnažanja bila je jednaka kao u kulturi četverogodišnjih genotipova (5,0). Svi pojedinačno izolirani izdanci su nakon 10—14 dana zakorjenjeni na podlozi mod. ACM uz dodatak 1,0 nM TBA. DISKUSIJA Rezultati dobiveni provedenim istraživanjima pokazali su da se vrste Betula pendula, B. papyrifera i B. lutea mogu uspješno razmnožavati mikropropagacijskim postupkom. Uspješnost mikropropagacije ovih vrsla breza u kulturi in vitro nije uvjetovana samo izborom regulatora rastenja i hranidbene podloge nego i genetski. Razlike između njih očitovane su u svim fazama mikropropagacijskog postupka. Žuta breza u odnosu na preostale dvije je zahtjevnija vrsta. To je došlo do izražaja već u početnoj kulturi, a u fazi multiplikacije ona se umnažala manjom stopom. Također, za poboljšanje zakorjenjivanja izdanaka ove vrste potrebna su ispitivanja za svaki pojedinačni genotip. Razlike između genotipova iskazane u obimu dobivanja novih izdanaka, a zatim i kompletnih biljaka, koje su karakteristične za svaku pojedinu vrstu, mogu se tumačiti posjedovanjem različitog morfogenetskog potencijala svakog pojedinog genotipa (Farnha m i sur. 1982, Coleman i Ernst 1989, Sellmer i sur. 1989). Iako je u kulturi obične breze došlo do proliferacije izdanaka oni su bili nježnije građe, malih listova i tankih stabljika što je onemogućilo korištenje svih pojedinačnih aksilarnih pupova za održavanje kulture izdanaka. Stoga je i stopa umnažanja kod ove vrste, prikazana kao broj segmenata izdanaka po inokulira nom eksplantatu, niža od očekivane. Istraživanje utjecaja starosti roditeljskih biljaka obične breze s kojih su izolirani početni eksplantati pokazalo je da je mikrokloniranje dvogodišnjih biljaka u odnosu na četverogodišnje, kao i odraslog stabla lakše i brže. Ovakav rezultat se mogao očekivati s obzirom na povoljniji fiziološki status juvenilnog biljnog materijala (B o n g a 1982, Welande r 1988). Chalup a (1981, 1983. i 1987) je u svom radu također koristio biljke različitih starosti ali nije dao detaljniji prikaz svojih rezultata, što upućuje na zaključak da to nije bilo presudno za uspješnost mikropropagacije obične breze. Isto bi se moglo tvrditi i za rezultate dobivene u ovom radu. Naime, uočene razlike nisu bitno utjecale na krajnji rezultat, te je svaka roditeljska biljka mogla poslužiti za masovnu proizvodnju sadnog materijala. Slični rezultati dobiveni su kod topola. Sadni materijal proizveden in vitro od roditeljskih stabala starih i preko 25 godina testira se već nekoliko godina na pokusnim parcelama širom zemlje (Kolevska-Pletikapić 1985). Stoga rezultati izloženi u ovom radu mogu u cijelosti poslužiti kao osnova za praktičnu primjenu mikropropagacije breza, obične, papiraste i žute. Posebice ona bi pridonijela rješavanju niza problema s kojima se susreću oplemenjivači u svojim istraživanjima na brezama. |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1991 str. 32 <-- 32 --> PDF |
ZAKLJUČAK 1. Mikropropagacijskim postupkom pomoću aksilarnih pupova moguće je klonsko razmnožavanje obične ili evropske breze (Betula pendula Roth.), papiraste breze (B. papvrifera Marsh.) i žute breze (B. lutea Michx.). 2. Razlike u morfogenetskom potencijalu između vrsta očituju se u svim fazama postupka. Osim toga, utvrđeno je da genotipovi također posjeduju različit morgofenetski potencijal. 3. Iako je starost roditeljskih biljaka s kojih su uzimani početni eksplantati utjecala na smanjenje stope umnažanja mikropropagacija adultnih breza je moguća. 4. Regeneracijom korjenovog sistema in vitro dobivene su kompletne biljke. Uspješnost zakorjenjivanja ovisi o vrsti breze i genotipu. Za razliku od obične i papiraste breze koje se lako zakorjenjuju in vitro, regeneracija korijena kod žute breze je nešto otežana. 5. Regenerirane kompletne biljke uspješno su se prilagodile na vanjske uvjete uzgoja te su se razvile u normalne sadnice. 6. Rezultati izloženi u ovom radu ukazuju na mogućnost korištenja tehnika in vitro za masovnu proizvodnju sadnog materijala breza. LITERATURA 1. Ahuja , M. R. (1983): Somatic differentiation and rapid clonal propagation of aspen. Silvae Genetica 32:131—135. 2. Bajaj , Y. P. S. (1986): Biotechnology of tree improvement for rapid propagation and biomass energy production. U: Y. P. S. Bajaj (Ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry 1 (Trees I), pp 1—23. 3. Bon g a, J. M. (1982): Vegetative propagation in relation to juvenility, maturity and rejuvenation. U: J. M. Bonga and D. J. Durzan (Ed.) Tissue Culture in Forestry. Martinus Nijhoff Publishers NV, The Hague, The Netherlands, pp. 387—412. 4. Bonga , J. M., D. J. Durza n (1987): Cell and Tissue Culture in Forestry Vol. 3 (Case Histories: Gymnosperms, Angiosperms and Palms. Martinus Nijhoff Publishers, The Netherlands. 5. Chalupa , V. (1981): Clonal propagation of broad-levaed forest tress in vitro. Communicationes Instituti Forestales Cechosloveniae, Vol. 12:255—271. 6. Chalupa , V. (1983): Micropropagation of conifers and broadleaved forest trees. Communicationes Instituti Forestales Cechosloveniae, Vol. 13:7—39. 7. Chalupa , V. (1987): European hardwoods. U: J. M. Bonga, D. J. Durzan (Ed.) Cell and Tissue Culture in Forestry, Vol. 3. Martinus Nijhoff Publishers. The Netherlands, pp. 224—246. 8. Coleman, G. D., S. G. Ernst (1989): In vitro shoot regeneration of Populus deltoides: effect of cytokinin and genotype. Plant Cell Reports 8:459— 462. 9. Farnham, R. S., S. Gar ton, K. A. Luis, P. E. Read (1982): Propagating and establishing bioenergy plantations. Proceedings. Energy Conservation and Use of Reneviable Energies in the Bio-Industries (2nd). Trinity Collage, Oxford. 10. Jovanović, M., A. Tucović, (1969): Neke odlike hibridnih breza nastali ukrštanjem vrsta sa različitim brojem kromosoma. Genetika 1 (1):43—58. |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1991 str. 33 <-- 33 --> PDF |
11. Karnosky , D. F. (1981): Potential for forest tree improvement via tissue culture. BioScience 31 (2): 114—120. 12. Kolevska-Pletikapić, B. (1985): Klonsko razmnožavanje Leuce topola metodom kulture tkiva. Topola 145—146: 3—8. 13. Kolevska-Pletikapić, B., Z. Tomović (1988): Mikropropagacija bagrema. Šumarstvo 5—6: 29—35. 14. Pe valek-Kozlina, B., S. Jelaska (1986): In vitro growth and development of oaks (Quercus robur and Q. petrea). Acta Botanica Croatica 45:55—61. 15. Sellmer, J. C, B. H. McCown, B. E. Haissig (1989): Shoot culture dynamics of six Populus clones. Tree Physiology 5:219—227. 16. Tu co vić, A., M. Jovanovi e (1970): Međuvrsna hibridizacija breza sa istim i različitim brojem kromosoma. Zbornik Instituta za šumarstvo i drvnu industriju 9:215—226. 17. Welander , M. (1988): Biochemical and anatomical studies of birch (Betulapendula Roth.) buds exposed to different climatic conditions in relation to growth in vitro. U: W. Hanover, D. E. Keathley (Eds.) Genetic Manipulation of Woody Plants. Basic Life Sciences, Vol. 44. Plenum Press. New York, pp. 243—264. Micropropagation of European birch (Betula pendula Roth.), paper birch (B. papyrifera Marsh.) and yellow birch (B. lutea Michx.) S u m m a r y The vegetative propagation by conventional methods which exploit natural mechanisms of asexual reproduction, rooting of cuttings and grafting, is time consuming and of limited success for many tree species. Tissue culture techniques offer a new dimension to tree improvement and may serve as an adjunct to conventional tree-breeding programs. In present paper we described how micropropagation technique could bee used in production and genotypes selection of three birch species Betula pendula, ß. papyrifera and B. lutea. Initial explants — axillary bud meristerns, were excised from two-, four- and twenty-year-old European birch, as well as from two-year-old paper and yellow birch. The branches were collected in winter to early spring before foliation. The modified aspen culture medium (ACM) with low concentration of cytokinin BA (2.2 u.M) was used as initial medium for shoot induction and multiplication. The differences observed in all micropropagation stages were affected by different morphogenetical capacity of tested species as well as their genotypes. Multiplication rate achieved was 4—6 nodal segments per explant. The adventitious root system was developed on the basal portion of shoots on the same medium composition (mod. ACM) supplemented with 1.0 u.M IBA. Plantlets which passed through hardening period, were developed into the normal plants in field conditions. The results presented in this paper showed, also, that our micropropagation method could bee used for propagation of mature birch trees. |