DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1985 str. 41 <-- 41 --> PDF |
Šum. list CIX (1985) 39 UDK 631.466.1.001 PROUČAVANJE MIKROORGANIZAMA TLA DIREKTNIM BIOLOŠKIM METODAMA Miroslav SOJAT* SAŽETAK. Autor predlaže za direktno mikroskopiranje tla dvije modifikacije standardne tehnike, modifikaciju sa spljoštenim agregatima tla i modifikaciju sa sedimentiranom suspenzijom tla. Prednosti tih dviju metoda su u tome, što nisu potrebna dodatna sredstva (bojanje) ni uzgoj na umjetnoj podlozi, pa se forme mikrofunga vide u potpuno prirodnoj morfologiji. U provedenim pokusima uočene su i do sada nepoznate forme mikroorganizama, osobito gljiva, (op) UVOD Postoje dvije velike skupine metoda za proučavanje mikroorganizama tla. Jednu skupinu tvore indirektne mikrobiološke metode (od kojih je najvažnija diluciona metoda, već opisana u ovom časopisu), a drugu tvore direktne metode sa raznim modifikacijama, Broj direktnih metoda prilično je velik. Vrlo dobro su poznate Rossi - Holodni (1927 — 1930) (13) i Pcrfiljev-Gabe (1960) (13) (10) metode. Naročito često upotrebljavana ije Perfiljev-Gabe metoda u modifikaciji Ariš tovskaje (19). Dobro je poznata Jones-Mollison (1948) (5) metoda za direktno brojanje mikroorganizama tla i za njihovo opažanje. Con n (1918) (2) i Vinogradsk i (1924) (2) bojili su suspenziju tla sa kiselim bojama. Strugge r (1949) (2) koristio je za mikroskopiranje suspenzije tla fluorescentu mikroskopiju sa akridin oranžom. Tada su stanice mikroorganizama zelene. Ku b i e n a je dao veliki doprinos direktnoj mikroskopiji tla (1938) (7). H o 1 o d n i je predložio metodu sa komoricama tla (1949) (13) i metodu sa prahom tla (1936) (13). Moramo još spomenuti Rossi-Holodni metodu u modifikaciji R i b a 1k i n e i Kononemko (14). metodu Ni k i t i n a (1970) sa elektronskom mikroskopijom tla. metode Thorntona (1952) (11), Chesters-a (1948) (11) itd. Uz ove navedene metode predlažem za direktno mikroskopiranje tla slijedeće modifikacije standardnih tehnika: modifikacija sa spljoštenim agregatima tla i modifikaciju sa sedimentiranom suspenzijom tla. * Mr Miroslav Sojat, ciipl. inž. Šumarski institut Jastrebarsko |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1985 str. 42 <-- 42 --> PDF |
MATERIJAL I METODIKA Tlo za mikroskopiranje uzimano je sa podnožja Zagrebačke gore. Tu se nalaze rendzina na lithotamniijskom vapnencu i ranker na rastresenom karbonatnom filitu. Da bi se moglo usporediti kako sezona, odnosno različiti periodi godine, djeluju na dobivene rezultate, uzorci su uzimani tijekom zime, u proljeće ljeti i u jesen. Zimi su uzorci uzimani po vrlo hladnom vremenu, transportirani i uskladišteni. Nastojalo se da period uskladištenja bude što kraći. U epruvetu (dimenzija 18 x 180 mm) stavlja se 4—5 g tla u 16 — 18 ml vode, glicerina ili alkohola (jedno od ta tri otapala). Nakon mućkanja, mikro- strukturni agregati, koji se nisu dislocirali, stave se u kap vode ili glicerina na objektnom staklu i poklope sa pokrovnim stakalcem. Kap alkohola nije podesna, jer brzo hlapi. Pomoću fino zašiljenog drvca pritišće se po stakalcu, na mjestu gdje se u preparatu nalazi agregat tla. Na taj način spljoštavamo agregat. Katkada je za tu svrhu dovoljna već sama težina pokrovnog stakalca. Mikroskopira se sa okularima povećanja 10 x i 16 x, te sa objektivima povećanja 40 x i 50 x. Pri tome postaju vidljiva fungalne strukture i razni mikroorganizmi perifernog dijela agregata. Slijedi opis druge tehnike. Najprije se pripremi suspenzija kao i kod naprijed opisane metode. Suspenzija je međutim previše rijetka, pa treba mnogo vremena potrošiti za njeno mikroskopiranje. Da se to izbjegne, pomoću manje pipete malog dijametra (2 mm na pr.) upije se suspenzija tla i pipeta se nagne u ikosi položaj. Izvjesno vrijeme se pričeka, da se suspenzija u pipeti sedimentira. Zatim se kap sendimentirane suspenzije kapne na objektno staklo i tako mikroskopira ili se prije mikroskopiranja stavi pokrovno stakalce, što je možda bolje. REZULTATI Metodom spljošnjavanja agregata tla dobiveni su slijedeći rezultati: opazene su fruktifikacije od Mucor sp., Penincillium sp., i Fusarium sp. Također više puta opaženi su konidiofori sličnim onSma od Verticilium sp. Uočene su spore, koje jako lome svjetlo, inkrustirane hife, septirane i ne-septirane hife, septirani vjerovatno algalni filament sa fuzioformnim nukleusima, smeđo interkalarne spore, akrogene spore debelih mebrana itd. Opažene su različite fruktifikacije koje spadaju u Fungi imperfeeti, sa morfologijom katkada različitom od mikro-fungi kultiviranih in vitro na hranjivim agariziranim supstratima, opažene su lanceolatne spore, sporangiji crne boje, eliptične spore smještene nasuprotne, acikularne hife. fruktifikacije sa angularnim sporama. nađena je zigota od Mucor sp. sa krenulatnom površinom. Opažen je sporangij na čijem apikalnom dijelu su klijale spore u obliku čuperka. Usprkos toga on još nije bio disociran. Sa sedimentiranom suspenzijom dobijeni su isti ili drukčiji nalazi od onih sa spljoštenim agregatima tla. Tako su na pr. opažene fruktifikacije od Mucor sp., od Penicillium sp., katenulatne spore, akrogene spore, fuziformne spore sa izrazitim membranama, burziformne tvorbe, eliptične spore, angularne spore kod izvjesnih fruktifikacija, konidiofori sa pršljenastim tvorbama itd. Treba istaći da se neke nađene tvorbe razlikuju po morfologiji od kulturalnih formi koje se mogu dobiti in vitro. |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1985 str. 43 <-- 43 --> PDF |
RASPRAVA I ZAKLJUČCI Mnoge su fungalne strukture zapažene samo jednom i nema nade da bi se mogle barem još jednom naći. To se može protumačiti time što su fruktifikacije -vrlo rijetke, a tlo je najčešće fizikalno-kemijski pa i mikrobiološki vrlo heterogeno. Neki mikrobiolozi jasno tvrde da je broj fruktifikacija koje se mogu sa postojećim metodama naći u tlu, vrlo malen. Kod drugih se to indirektno vidi. Na pr. Zvjagince v (19) piše: »Pri mikroskopskom proučavanju neobojene vodene suspenzije tla, jasno je vidljiva samo nevelika količina stanica, pretežno štapićastih, ne često nalaze se fungalne hife i filamenti aktinomiceta.« Dakle Zvjagincev uopće ne spominje fruktifikacije. K u b i e n a (7) je posvetio čitavu knjigu (točnije znatni njen dio) proučavanju tla sa direktnim metodama. On nije dobio veliki broj fungalnih fruktifikacija. Mnoge je uspio determinirati, ali zahvaljujući sasvim posebnoj metodici. Prema Li t vino v u (8) za determiniranje vrste mikro-fungi, a katkada čak i roda, potrebno je više od 1—2 konidiofora, tako da se u determinacije Kubien e (7) može sumnjati. Pochon i de Barjac (11) tvrde da je kod direktnih metoda nemoguća identifikacija mikroorganizama. Vlastito iskustvo pokazuje da je katkada moguća identifikacija uz upotrebu suspenzije, ali pretežno do roda, a rijetko do vrste. Mikrobiolozi koji su radili sa direktnim metodama, trebali su navesti, koliko vremena je potrošeno da bi se dobio jedan nalaz. U vegetacionoj sezoni opaženo je ekstremno malo mikro-fungi. To se naročito odnosi na fruktifikacije. Najviše ih je dobiveno zimi. Izgleda da prisustvo snijega stimulira tvorbu fruktifikacija. Moguće je izolirati gljivice iz tla, zatim uzgojiti na umjetnoj podlozi, pa determinirati. Međutim, to je teško realizirati. Za istraživano tlo, preporučljivo je upotrijebiti što veći broj metoda, kako direktnih tako i indirektnih. Kao primjer za to mogu poslužiti istraživanja S žabo-a (15). Nije točno da su direktne metode rijetko upotrebljavane, kako neki tvrde (1). Ako se primjeni metodika, koja je u ovom radu primjenjena, onda se u proljeće, ljeti i u jesen dobivaju oskudni rezultati. Promatrane forme mikro-fungi imale su potpuno prirodnu morfologiju, jer su se razvijale u prirodi, u tlu koje nije bilo tretirano na nikakav umjetni način (kod nekih direktnih metoda dodaju se tlu agar, škrob itd., dakle supstance koje nisu prirodni sastojci tla). Također su uočene još nepoznate forme mikroorganizama tla, naročito gljivica. Dakle nalazi se ne slažu sa nalazima onih istraživača koji su dobili samo banalne forme mikroorganizama, posebno gljivica. LITERATURA 1. A 1 e x a n d e r. M.: Introduction to soli microbiologv. Second ed. New York, 1977. 2. Beck, T.: Mikrobiologie des Bodens. Munchen. 1968. 3. G i 1 m a n, J. C: A manual of soiO Fungi. Ames, Iowa, Second ed. 1957. 4. Jerotijević , H.: Praktikum za mikrobiologiju. Beograd, 1973. 5. Jone s iMollison : A techniique for the quantitative estimation of soil micro- organisms. J. gen. Microbiol. 2. 54—69 (1948). |
| ŠUMARSKI LIST 1-2/1985 str. 44 <-- 44 --> PDF |
6. Koleško , O. I.: Ekologija mikro-organizmov počvi. Lab. praktikum. Minsk, 1981. 7. K u b i e n a. W.: Micropedology. Ames. 1938. 8. Li t vi nov. M. A.: Opredelltelj mikroskopičeskih počvenih gribov. Lenjingrad, 1967. 9. Ocevski , B.: Metode mikrobiološkog ispitivanja vode i mulja. U knjizi: »Mikrobiološke metode ispitivanja zemljišta i voda« ed Tešić Z. i Todorović M., Beograd, 1966. 10. Parkinson . D. et al.: Methods l´or Studying the Ecologv of Soil Micro-organisms. London. 1971. 11. P o c h o n, J. i H. de Barjac: Traite de microbiologie des sols. Pariš, 1958. 12. Pochon , J. li T a r d i e u x, P.: Techniques d´analvse en microbiologie du sol. Pariš, 1.962. 13. Radulovič . V.: Neposredno posmatranje mikroorganizama u zemljištu. U knjizi: »Mikrobiološke metode ispitivanja zemljišta i voda« ed. Tešić 2. i M. Todorović, Beograd. 1966. 14. R i b a 1 k i n a, A. V.: Komparativna procjena nekih direktnih metoda istraživanja u mikrobiologiji tla. U knjizi: »Mikroorganizmi u seoskom gospodarstvu«, Moskva, 1970. 15. S z a b o, I. M.: Microbial communitdes in a forest — rendzina ecosvstem. Budapest, 1974. 16. Szegi , J.: Metodi počvenoj mikrobiologu. Moskva, 1983. 17. Soj at, M.: Proučavanje gljiva u tlu primjenom raznih mikrobioloških metoda. Mag. rad, Zagreb, 1970. 18. W a r c u p. J. H.: Fungi in soil. U knjizi »Soil Biologv« ed. A. Burges i F. Raw, London, 1967. 19. Zvjagincev . D. G.: Prvi dio priručnika, čiji je ed. N. A. Krasiljnikov. Naslov priručnika: Metode proučavanja mikroorganizama tla i njihovih metabolita, Moskva, 1966. STUDY OF SOIL MICROORGANISMS BY DIRECT BIOLOGICAL METHODS S u m m a r y The author suggests two modifications of standard technique tor the direct microscoping of soil: modification \vith flattened soil aggregates and modification with sedimentarv soil suspension. In the i´irst modification a drop of suspended soil (in water, glvcerin or alcohol) is placed on the microscopic stage, covered with a slide and pressed with a finelv sharpened wooden stick to flatten the drop. In the second method a drop of suspended soil is placed on the microscopic stage by means of a pipette and is observed with or without a slide. The advantages of these two methods compared to standard ones are that thev do not need either additional means (staining) or cultivation on an artifical substrate, so that forms of mieroorganisms have entirelv natural morphology. In the investigations carried out to date some unknown microorganic forms. especially fungi, have been observed. |